五种植物精油抗菌及抗氧化活性研究

■罗飞亚 杨慧超 刘梦婷 曾建国，3*

(1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南农业大学中兽药湖南省重点实验室，湖南长沙410128；3.湖南农业大学兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心，湖南长沙410128）

谷物在贮存过程中容易发生腐烂酸败现象，尤其是一些油脂类成分含量高的产品，这就给企业甚至国家造成了巨大的经济损失。变质的谷物不仅会导致其营养成分的损失，而且会危害人类健康。而谷物在贮存过程中腐烂酸败多是由于物理、化学及微生物影响所致，其中微生物的影响最为明显[1]。吴国锋[2]指出我国小麦粉主要是由芽孢菌群、大肠菌群等微生物影响，其中细菌量的典型数值为104CFU/g，大肠菌群典型数值为102CFU/g，芽孢菌总数的典型数值为103CFU/g。井勇[3]报道谷物霉变主要是由于曲霉菌属引起。一直以来，人们为了解决谷物在贮存过程中腐烂酸败的问题，长期的做法是添加防腐剂、防虫剂等[4]，而此类物质多是化学物质，具有一定毒性，对人类的健康存在着极大的安全隐患。因此，寻找一种新型的防霉防腐剂和抗氧化剂来解决谷物在贮存过程发生的腐烂酸败问题显得尤为重要。

植物精油是从芳香植物中提取的一类天然物质，我国植物资源丰富，为开发利用植物精油提供了有利条件。植物精油成分复杂，多由几十至上百种化合物组成，大都具有特殊香味，并具有一定的抗菌和抗氧化能力[5]，因此广泛受到人们的关注。王放银等[6]研究表明石香薷精油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有良好的抑制效果；张有林等[7]研究百里香精油的抗菌及抗氧化活性，结果显示百里香精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉菌、啤酒酵母菌的抗菌性均表现为敏感型，且其具有较强的抗氧化能力；柴向华等[8]研究表明罗勒精油对霉菌有较好的抑制作用；贾佳等[9]通过肉汤稀释法和琼脂扩散法研究迷迭香精油的抑菌活性，结果表明迷迭香精油具有广谱抗菌作用。王新伟等[10]研究表明牛至油对面包酵母和黑曲霉菌有较好的抑制作用。而目前对精油的研究大都集中在单一品种的抗菌和抗氧化，缺少对多种植物精油的比较研究，对精油植物资源的研究开发带来不便。本文选取了五种植物精油并研究其抗菌、抗氧化作用，为更好地将植物精油开发成新型的防霉防腐剂提供参考。

1 仪器和材料

1.1 仪器

电子调温电热套（98-1-B型，天津市泰斯特仪器有限公司）；PL203 电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；UV2400型紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；酶标仪（NanoQuant in⁃finite M200Pro TECAN）；ZHWY-103D 型台式恒温振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司）；SPX-150型生化培养箱（北京市永安光明医疗仪器厂）；LDZF-75KB-Ⅱ型立体蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

1.2 材料

药材：石香薷（Mosla chinensis Maxim.，湖南新宁）、迷迭香（Rosmarinus officinalis Linn.，湖南长沙）、牛至（Origanum vulgare Linn.，湖南长沙）、百里香（Thymus mongolicus Ronn.，山东青岛）、罗勒（Oci⁃mum basilicum Linn.，山东青岛）。

试剂：DPPH(50 mg/瓶)、总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP 法，碧云天生物技术)、吐温-80、无水硫酸钠(分析纯，500 g/瓶)、没食子酸丙酯（PG，化学纯，100 g/瓶)、抗坏血酸（VC，1 g/瓶，阿拉丁）、马铃薯葡萄糖水培养基（PDA），水为蒸馏水，tryptone、yeast ex⁃tract（OXOID），氯化钠(分析纯)、琼脂粉。

菌种：大肠杆菌(Escherichiacoli, E.Coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.a)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis, S.e)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis, B.s)，黑曲霉菌（Aspergillus Niger），所有供试菌种均来自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。

2 方法

2.1 植物精油的提取

参考王书平等[11]方法。将五种药材切断至1 cm左右，分别取200 g于圆底烧瓶中，加水1 200～1 600 ml，使水刚好浸没药材为宜，震荡摇匀后，静置30 min，然后连接挥发油测定器和冷凝回流管。从冷凝回流管上端加水至挥发油测定器刻度线，并出现水流入圆底烧瓶的现象为止。然后用电热套加热至沸腾，并保持微沸4 h，停止加热。静置片刻后，打开挥发油提取器下端活塞，收集精油，用无水硫酸钠除水后置于棕色瓶中，4 ℃保存备用，并计算各药材的提取率。

2.2 植物精油的抗氧化活性测定

2.2.1 植物精油对DPPH·的清除率的测定

准确称取0.019 7 g DPPH·溶解于无水乙醇中，定容于250 ml 棕色容量瓶中，即配制成2×10-4mol/l的DPPH·乙醇溶液，低温储藏备用；另取适量精油用无水乙醇溶解，分别配制成1、5、10、20、40、80 μg/ml的精油乙醇溶液，低温储藏备用。

参照Kaan 等[12]和Thaipong 等[13]的方法。吸取2 ml 2×10-4mol/l 的DPPH·乙醇溶液，再加入2 ml 无水乙醇，置于具塞试管中，记作A0；另取两根具塞试管各加入2 ml 1 μg/ml 的精油溶液，然后分别加入2 ml 2×10-4mol/l 的DPPH·乙醇溶液、2 ml 无水乙醇溶液，分别记作Ai和Aj。用力摇匀。将A0、Ai和Aj所表示的样品在室温暗处静置反应30 min，加入比色皿中，在波长517 nm 处进行吸光度的测定，以无水乙醇作为对照调零，分别测出A0、Ai和Aj所示样品的吸光度值。同理分别测定出5、10、20、40、80 μg/ml的精油溶液的吸光度值，并用PG和VC做阳性对照。每个浓度重复3次，记录平均值。植物精油对DPPH·的清除率（SR%）按下面公式计算。

2.2.2 植物精油总抗氧化能力的测定（FRAP法）

集控台上和机旁控制面板上均设有车钟显示板，用于使机旁试车工作人员及时掌握主机的运行状态(车令复示功能)和与集控台操作人员的通信(辅车钟通信功能)。

参照陈玉霞等[14]方法。96 孔板的每个检测孔中加入180 μl FRAP工作液，空白对照孔中加入5 μl蒸馏水，样品检测孔内分别加入5 μl 不同体积分数的精油溶液。以Trolox作为阳性对照。37 ℃孵育3～5 min在593 nm 处测定其吸光度。以FeSO4标准溶液测定绘制标准曲线，样品的总抗氧化能力以FRAP 值来表示，1 FRAP 值与1 mmol/l FeSO4相当。图1 为FeSO4标准曲线，求得其回归方程为Y=0.306x+0.052 7，相关系数为R2=0.999 1。

图1 FeSO4标准曲线

2.3 植物精油的抑菌圈测定

采用滤纸片扩散法[15]，在无菌条件下，吸取2 μl精油于滤纸片（d=6 mm）上，并使其完全均匀分散，自然风干，贴到涂抹适宜浓度菌悬液（1×106～107CFU/ml）的培养基平板上，每皿2 片并以无菌水作对照，重复3 次，37 ℃培养12 h，十字交叉法[16]测定抑菌圈大小。

2.4 植物精油最低抑菌浓度（MIC）测定

采用二倍稀释法[17-18]，并稍作改变。将五种精油分别用1%的吐温-80 水溶液稀释成160 μl/ml 的溶液。取无菌试管10支，排成一排，编号1～10。除1号管中加入1.6 ml LB 培养基，其余各管各加入1 ml LB 培养基。然后再加入0.4 ml 精油溶液至1 号管，混匀，从1 号管中吸取1 ml 液体加入至2 号管，混匀后吸取1 ml 加入3 号管，以此类推，8 号管中吸取1 ml 液体弃去。9 号管为不含精油溶液的生长对照，10 号管为空白对照。然后在1～8 号每管内加入菌液1 ml，使精油浓度最终为0.125～16 μl/ml，最终菌液浓度为1×106～107CFU/ml。将接种好的试管，于37 ℃培养6 h，然后吸取100 μl 涂布琼脂平板，再于37 ℃培养12 h，观察，无细菌生长的为最低抑菌浓度（MIC），在此基础上继续培养12 h，仍无细菌生长的为最低杀菌浓度（MBC）。

2.5 植物精油对真菌的抑制作用测定

参考马萱等[19]的方法。挑取适量黑曲霉菌孢子，接种在PDA 培养基上，于28 ℃培养箱中培养7 d，倒入5 ml无菌水，轻轻洗下孢子，制成孢子悬浮液，使孢子浓度大约在1×104个/ml。然后用移液枪取100 μl的孢子悬浮液加到已制好的PDA平板上，用灭菌的涂布棒涂匀，将含有2 μl 精油的滤纸片放在培养皿中心，重复3次，以不加滤纸片作为生长对照，28 ℃培养一周，观察并记录霉菌生长情况。

3 结果

3.1 植物精油的提取结果分析

实验结果表明，植物精油的提取率（v/m）随时间的延长而增大，在蒸馏4 h 后进而达到饱和。石香薷精油的提取率为1.73%，迷迭香精油的提取率为1.90%，百里香精油的提取率为0.75%，牛至精油提取率为0.30%，罗勒精油的提取率为0.13%。

3.2 DPPH·清除实验结果分析

五种植物精油清除DPPH自由基的实验结果如图2所示，五种植物精油对DPPH·的清除率大小与其浓度呈正向相关。石香薷精油的IC50=1.92 μg/ml，迷迭香精油的IC50=20.36 μg/ml，罗勒精油的IC50＜1 μg/ml，百里香精油的IC50＜1.42 μg/ml，牛至精油的IC50＜1.47 μg/ml。总体来看，五种植物精油表现出较强的清除DPPH·的能力。百里香精油对DPPH·的IC50值稍小于牛至精油，但牛至精油在达到饱和点的清除率却稍大于百里香精油，说明牛至精油清除DPPH·的能力要略强于百里香精油，而抗氧化剂表现出来的抗氧化活性大小一般是酚类＞醛类＞醇类，本研究中所选五种植物精油其化学成分都含有大量的酚类以及烯烃类化合物，如百里香酚、对伞花烃、香芹酚等[20-24]，因此其具有较强的清除DPPH·的能力。

图2 五种植物精油对DPPH·的清除率

3.3 总抗氧化能力结果分析

由图1 可知，FeSO4标准曲线在0.15～1.5 mmol/l之间线性关系良好。图3 为五种精油溶液的FRAP值测定结果。可以看出，五种植物精油的总抗氧化能力大小为罗勒精油＞牛至精油＞石香薷精油＞百里香精油＞迷迭香精油，罗勒精油的抗氧化能力远远高于其他四种精油，迷迭香精油的总抗氧化能力远远低于其他四种精油。同理测得对照组Trolox 的相对总抗氧化能力为2.03±0.11，与其比较而言，本实验研究的五种植物精油都具有较强的抗氧化能力。

图3 五种精油的FRAP值

3.4 植物精油的抑菌活性结果分析

3.4.1 植物精油的抑菌活性(见表1)

如表1所示，五种植物精油对四种病原菌都展现出了抑制作用，其中石香薷精油、百里香精油、牛至精油对S.a 抑制作用较强，而其对E.Coli、B.s、S.e 的抑菌效果相当。迷迭香精油对四种病原菌的抑制效果都较差，罗勒精油对S.a的抑制作用一般，但仍要强于其对E.Coli、B.s、S.e的抑制作用。

3.4.2 植物精油的MIC和MBC测定结果

采用肉汤稀释法测定了五种植物精油的MIC 和MBC，植物精油对四种病原菌的MIC 和MBC 见表2。石香薷精油对S.a、B.s、S.e的MIC值为1 μl/ml，MBC值分别为2、1、2 μl/ml，对E.coli 的MIC 值为2 μl/ml，MBC 为4 μl/ml，显示了石香薷精油具有较强的抑菌和杀菌能力。同样牛至精油和百里香油也具有良好的抑菌能力，MIC 在1～4 μl/ml 之间。而迷迭香精油和罗勒精油的抑菌能力就显得较弱，这也与抑菌圈实验结果具有一致性，其对四种病原菌的MBC 值更是达到了16 μl/ml，但迷迭香精油对S.e 的MIC 和MBC值一样，都为4 μl/ml。

表1 五种植物精油对不同菌种的抑菌圈的影响(mm)

表2 植物精油对四种病原菌的MIC和MBC(μl/ml)

3.4.3 植物精油对黑曲霉菌的抑制结果分析(见表3)

由表3 可知，其中石香薷精油组在培养前3 d 都无霉菌生长，培养至第4 d 开始有少量霉菌生长，至第7 d 大量生长至一皿；百里香精油组在第3 d 开始有霉菌生长，培养第5 d 霉菌开始大量生长；而牛至精油是在培养第2 d 开始有霉菌生长，培养至第5 d有霉菌大量生长。可以看出本研究中，石香薷精油对霉菌抑制效果最好，其次是百里香精油、牛至精油，而迷迭香精油和罗勒精油对霉菌几乎没有抑制作用。

表3 植物精油对黑曲霉菌的抑制作用

4 讨论

我国芳香植物资源丰富，在植物精油的原料选择方面有着独特的优势。本研究中石香薷、迷迭香、百里香等植物精油的提取率较高，分别达到了1.73%、1.90%、0.75%。选择精油提取率较高的植物开发利用，可以极大的节约成本。

本研究通过DPPH·清除实验和FRAP 法测定了五种精油的抗氧化能力，结果显示五种植物精油对DPPH·都表现出了较强的清除能力，其中罗勒精油清除DPPH·的能力最强，IC50＜1 μg/ml，而石香薷精油、百里香精油、牛至精油的IC50值相当，迷迭香的IC50值高于其他四种精油。另外，五种植物精油的总抗氧化能力也和清除DPPH·的能力表现出一致性，罗勒精油的总抗氧化能力最强，其FRAP值达到了1 536.67，相比之下迷迭香精油的总抗氧化能力很低，其FRAP 值只有22.14，与报道相差较大[26]，可能是由于地域原因导致精油中有效化学成分含量不同，从而影响其清除自由基的能力。

本研究中五种植物精油在抑制微生物生长方面表现出不同的能力，其中石香薷精油、百里香精油、牛至油展现出了广谱抗菌作用，不仅对实验中四种供试细菌有较好的抑制效果，而且对黑曲霉菌也表现出了较强的抑制作用，尤其对S.a 的抑制作用最为明显（抑菌圈大于30 mm）。相比之下，迷迭香精油对四种供试细菌的抑菌能力较弱，罗勒精油对S.a 有较明显的抑制作用，但其杀菌浓度较高，而罗勒精油和迷迭香精油对黑曲霉菌都没有抑制作用。

植物精油可作为一种新型的天然、绿色、无毒的防霉防腐剂开发应用，前景广阔。本研究表明石香薷精油、百里香精油、牛至精油具有良好的抗菌抗氧化作用，而罗勒精油具有极强的抗氧化能力，但其抗菌作用略弱，后期考虑复配精油进行深入研究。同时希望通过更深入的研究挖掘出更多芳香植物精油[27-28]，以便在将来替代化学类防霉防腐剂应用于生活的各个领域。