同型半胱氨酸影响Caco-2细胞通透性的机制研究

姚成云，丁少桢，杨 青，刘晓昌，徐张巍，梅 俏，许建明

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种发病机制尚不明确的肠道炎症性疾病[1]，肠黏膜屏障通透性改变在IBD的发生与发展中有重要作用。紧密连接(tight junction，TJ)是肠黏膜上皮机械屏障中的重要结构[2]，TJ损伤引起的肠上皮通透性增加，参与了IBD病理生理过程。跨膜蛋白(包括Claudin及Occludin)和外周蛋白是TJ的主要结构蛋白，受肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)调控，引起TJ通透性改变，参与肠黏膜通透性的调节[3]。

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是一种含硫氨基酸,可通过多种机制参与血管内皮细胞屏障损伤过程。IBD患者血浆及结肠中Hcy水平升高，且Hcy能够损伤肠上皮细胞线粒体功能[4]，但Hcy是否通过调控MLCK蛋白影响肠上皮TJ通透性目前尚不明确。该研究在建立Caco-2模型基础上，研究Hcy是否参与调控MLCK蛋白表达影响肠黏膜通透性及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

1.1.1实验细胞 Caco-2细胞，购于中国科学院上海生命科学研究院。

1.1.2药品与试剂 同型半胱氨酸、异硫氰酸荧光素、ML-7、SB203580、DEME高糖培养基、非必需氨基酸、胰蛋白酶均购于美国Sigma-Aldrich公司；MLCK、MEK、ERK、p-ERK、Claudin-1、Claudin-2购于南京Bioworld公司；Occludin购于美国Proteintech公司；p-MLCK购于美国Santa Cruz公司；KN62、PD98059、Staurosporine、Y27632购于美国Selleck公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；L-谷氨酰胺购于美国Gibco公司；青霉素-链霉素混合溶液购于上海笃玛生物科技公司。

1.1.3主要仪器 F2700型荧光分光光度计，购于日本岛津公司；Transwell小室(型号3413)，购于美国Corning公司；Millicel@-ERS细胞电阻仪，购于德国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1Caco-2细胞通透性模型的建立及分组 Caco-2细胞通透性模型的建立：Caco-2结肠癌细胞培养条件为37 ℃、5% CO2、95%空气湿度，培养基使用含15%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺及1%青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养基培养。每2～3天进行换液，当细胞生长至80%连续时，使用含0.05% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液，以5×105个/孔的密度接种于12孔Transwell incerts(孔径0.4 μm)的上槽中。接种后，每2天换液，1周后改为每天换液，直至21 d。Caco-2结肠癌细胞分为空白对照组、Hcy处理组(10、20、50 μmol/L)、Hcy+信号通路抑制剂处理组(ERK抑制剂PD98059、MLCK抑制剂ML-7、P38MAPK抑制剂SB203580、Ca2+/Calmodulin抑制剂KN62、Rho抑制剂Y27632及PKC抑制剂Staurosporine)。

1.2.2Caco-2细胞通透性检测 Caco-2细胞模型的通透性通过检测跨上皮电流阻抗(transepithelial electrical resistance，TEER)及异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)跨膜转运量改变来评估。弃去12孔板中培养基，加入含不同浓度Hcy(10、20、50 μmol/L)的PBS液孵育后，通过对TEER及FITC转运进行检测来确定Hcy的最优浓度。TEER采用Millicell ERS细胞电阻仪测量，实验开始后每30分钟检测TEER并记录，同时于下槽取样并保存于4 ℃冰箱中，直至第180分钟实验结束。收集的样品经稀释、离心后使用荧光分光光度计检测样品上清液中FITC荧光值(设置激发波长为380 nm,吸收波长为425 nm)，并根据标准曲线方程计算出样品中FITC浓度，即FITC跨膜转运量，借此评估Caco-2细胞模型的通透性。实验结束后将Caco-2细胞用胰酶消化并收集细胞悬液，保存于液氮中用于Western blot检测。

1.2.3Western blot法检测Caco-2细胞中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK、ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin蛋白表达水平 从Caco-2细胞中提取蛋白质，使用SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜。在室温下用封闭液(5%脱脂乳)封闭2 h。将膜与一抗在4 ℃温育过夜。一抗包括抗MEK(1 ∶500)、ERK(1 ∶1 000)、p-ERK(1 ∶2 000)、MLCK(1 ∶500)、p-MLCK(1 ∶200)、ZO-1(1 ∶500)、Claudin-1(1 ∶500)、Claudin-2(1 ∶500)、Occludin(1 ∶600)和beta-actin(1 ∶1 000)。TBST洗涤，将HRP连接的二抗在室温下与膜温育2 h。再次洗涤，使用ECL蛋白质印迹检测系统和Image J软件检测分析结果。

1.3 统计学处理计数资料采用SPSS 16.0软件分析，两两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hcy对Caco-2细胞通透性的影响使用不同浓度Hcy(0、10、20、50 μmol/L)处理Caco-2细胞，记录TEER和FITC跨膜转运量随时间的改变，结果显示，随Hcy浓度的增加Caco-2细胞TEER逐渐降低，FITC跨膜转运量逐渐增加。当使用50 μmol/L Hcy处理Caco-2细胞时，TEER(图1A)及FITC跨膜转运量(图1B)改变速率最快。表明Hcy能够增加Caco-2细胞的通透性且具有浓度依赖性，后续采用50 μmol/L Hcy进行作用机制研究。

图1 不同浓度Hcy对Caco-2细胞TEER和FITC跨膜转运量的影响

A：Caco-2细胞TEER随Hcy浓度的变化；B：Caco-2细胞FITC跨膜转运量随Hcy浓度的变化

2.2 MLCK抑制剂ML-7对Hcy增加Caco-2细胞通透性的影响与Hcy处理组比较，Hcy+ML-7处理组Caco-2细胞TEER增加(图2A)，FITC跨膜转运量显著减少[(31.23±9.01) μg/mlvs(43.05±14) μg/ml,t=2.459,P<0.05](图2B)，提示MLCK抑制剂具有抑制Hcy引起Caco-2细胞通透性增加的作用，MLCK可能在Hcy增加Caco-2细胞通透性过程中发挥作用。

2.3 PD98059、SB203580、KN62、Y27632和staurosporine对Hcy增加Caco-2细胞通透性的影响与Hcy组比较，Hcy+PD98059处理组Caco-2细胞TEER增加，FITC跨膜转运量显著减少[(30.83±5.96) μg/mlvs(41.9±8.29) μg/ml,t=3.756,P<0.05；而SB203580、KN62、Y27632、staurosporine对Hcy处理后Caco-2细胞的TEER和FITC跨膜转运量无显著影响，提示ERK-MLCK信号通路在Hcy增加Caco-2细胞通透性过程中发挥作用(图3)。

图2 ML-7抑制Hcy引起的Caco-2细胞通透性增加

A：ML-7增加Hcy 处理后Caco-2细胞的TEER；B:ML-7降低Hcy处理后Caco-2细胞的FITC跨膜转运量；与Hcy组比较：*P<0.05

2.4 Hcy对Caco-2细胞中细胞连接蛋白表达的影响Western blot检测结果显示，与对照组比较，50 μmol/L Hcy处理的Caco-2细胞中细胞连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin蛋白表达减少，Claudin-2蛋白表达增加(图4)。

2.5 ML-7和PD98059对Hcy处理后Caco-2细胞中细胞连接蛋白表达的影响与Hcy组比较，Hcy+ML-7处理组(图5A)和Hcy+PD98059处理组(图5B)Caco-2细胞中ZO-1、Claudin-1、Occludin蛋白表达均增加，Claudin-2蛋白表达均减少，提示抑制ERK-MLCK信号通路可能是Hcy调控Caco-2细胞中细胞连接蛋白表达的关键环节。

2.6 MEK-ERK-MLCK信号通路在Hcy增加Caco-2细胞通透性中的作用Western blot检测结果显示，50 μmol/L Hcy处理后Caco-2细胞中MEK、MLCK、p-MLCK、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达增加。而再分别使用ML-7(图6A)和PD98059(图6B)处理后Caco-2细胞中MEK、MLCK、p-MLCK、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达均下降。提示Hcy可能通过MEK-ERK-MLCK信号通路抑制细胞连接蛋白的表达，促进细胞通透性增加。

图3 不同信号通路抑制剂对Caco-2细胞TEER和FITC跨膜转运量的影响

A：Caco-2细胞TEER随Hcy浓度的变化；B:Caco-2细胞FITC跨膜转运量随Hcy浓度的变化；1.Hcy组;2.Hcy+PD98059组;3.Hcy+SB203580组;4.Hcy+Y27632组;5.Hcy+KN62组;6.Hcy+staurosporine组；与Hcy组比较：*P<0.05

图4 Hcy对Caco-2细胞中细胞连接蛋白表达的影响

图5 ML-7和PD98059对Hcy处理后Caco-2细胞中细胞连接蛋白表达的影响

A：ML-7促进Hcy处理后Caco-2细胞中ZO-1、Claudin-1、Occludin的表达，抑制Claudin-2的表达；B：PD98059促进Hcy处理后Caco-2细胞中ZO-1、Claudin-1、Occludin的表达，抑制Claudin-2的表达

图6 ML-7 和PD98059对Hcy处理后MEK-ERK-MLCK信号通路蛋白表达的影响

A：ML-7抑制Hcy处理后Caco-2细胞中MEK-ERK-MLCK信号通路蛋白的表达；B：PD98059抑制Hcy处理后Caco-2细胞中MEK-ERK-MLCK信号通路蛋白的表达

3 讨论

IBD是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，其病因和发病机制目前尚不完全清楚，肠黏膜免疫调节异常引起的炎症在IBD发病过程中起着重要作用。同型半胱氨酸是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物。Hcy通过刺激MMP合成，促进炎症因子表达如TNF-α，IL-6和IFN-γ，激活NADPH和p38MAPK，调控心血管内皮细胞的通透性。同时发现IBD患者结肠组织及血浆中Hcy水平较健康对照相比明显升高[5]，血管内皮细胞屏障与肠黏膜上皮屏障存在结构上的相似性，Hcy是否通过对肠道黏膜屏障通透性产生影响，参与IBD发病机制目前相关研究较少。

Caco-2细胞与人的肠道黏膜上皮细胞屏障在形态、极性以及转运体的表达上相似，被广泛用于研究肠道黏膜屏障功能调节的相关机制[6]。TJ是肠道黏膜屏障的关键结构，是顶端连接复合体的重要组成部分，控制细胞旁转运和调节肠上皮的通透性。Claudin-1在上皮细胞周围形成连续的封闭结构，起到固定TJ结构的关键作用。细胞中Claudin-1的过度表达有助于增加TEER[7]，Claudin-2参与形成跨膜通道运输水和小分子物质以及上皮细胞通透性调节[8]。Claudin-2基因敲除可使MDCK细胞TEER增加[9]。Occludin敲除小鼠的细胞旁通透性与野生型相比没有明显增加[10]。ZO-1连接跨膜蛋白与细胞骨架，细胞骨架对形成TJ结构起着重要作用[11]，敲除ZO-1会引起TJ结构与功能的破坏[12]。本研究中，对Hcy处理Caco-2细胞的检测表明，Hcy可降低Caco-2细胞中ZO-1、Claudin-1、Occludin蛋白表达，增加Claudin-2表达，提示Hcy可通过影响Caco-2细胞TJ蛋白影响Caco-2细胞通透性。

MLCK介导肌球蛋白轻链磷酸化通路是调控TJ结构及功能的重要信号通路。磷酸化的肌球蛋白轻链发生构象改变，引起肌动蛋白与肌球蛋白丝收缩，引起上皮细胞TJ开放，参与调节上皮细胞黏膜通透性的调节过程。 MLCK表达增加可以上调MLC磷酸化水平，导致血管内皮细胞收缩加剧，通透性增加，细胞形态和功能完整性遭到破坏[13]。Hcy作用于血管内皮细胞，可以促进其MLCK的表达[14]。本研究结果显示Hcy增加Caco-2细胞中MLCK、p-MLCK的蛋白表达，使用ML-7抑制剂预处理Caco-2细胞可明显改善Hcy引起的TEER降低，提示Hcy可以影响Caco-2细胞中MLCK磷酸化过程，调节Caco-2细胞通透性改变。

MLCK受P38MAPK、Rho激酶、ERK、钙调素依赖激酶、PKC等多种信号通路调控。研究[15]表明，MEK/ERK/MAPK信号通路参与MLCK功能调控，MEK可激活ERK促进ERK磷酸化，最后激活MLCK。本研究通过使用不同工具药(ERK抑制剂PD98059，P38MAPK抑制剂SB203580，Rho激酶抑制剂Y27632，钙调素依赖激酶抑制剂KN62，PKC抑制剂Staurosporine，MLCK抑制剂ML-7)干预Hcy处理的Caco-2细胞，结果提示Hcy主要通过MEK-ERK蛋白调节MLCK磷酸化，参与调节TJ功能。

本研究结果显示Hcy增加Caco-2细胞中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK的蛋白表达，使用PD98059及ML-7抑制剂预处理Caco-2细胞可明显改善Hcy引起的TEER降低，下调MLCK、Claudin-2蛋白表达，ZO-1、Claudin-1及Occludin表达有较大程度回升，提示Hcy可能通过促进MEK-ERK-MLCK蛋白磷酸化过程，影响TJ结构蛋白表达，损伤肠上皮细胞TJ，引起肠黏膜通透性增加，加重肠道炎症过程，为阐明IBD中Hcy影响肠黏膜通透性的作用机制提供实验依据。