毛菊苣提取物对小鼠肝纤维化的保护作用

张晓恒, 姚 佳, 秦冬梅

张晓恒, 江阴市中医肝胆医院 江苏省江阴市 214431

姚佳, 秦冬梅, 石河子大学药学院 新疆维吾尔自治区石河子市 832002

核心提要: 本研究探讨了毛菊苣提取物对小鼠肝纤维化的保护作用, 结果表明毛菊苣95%和70%醇提取物对CCl4造成的化学性肝纤维化具有治疗作用, 可为进一步探究毛菊苣中有效成分及其作用机制奠定前期基础.

0 引言

毛菊苣为菊科菊苣属植物, 系我国维吾尔习用药材, 具有清肝利胆, 健胃消食, 利尿消肿功效; 用于湿热黄疸,胃痛食少, 水肿尿少[1,2].肝纤维化是许多肝脏疾病的一个中间发展环节, 延缓或阻止肝纤维化的形成, 对防治肝硬化具有重要意义[3].经实验研究, 毛菊苣根95%(CG-Ⅰ)与乙醇50%(CG-Ⅲ)乙醇提取物中主要有倍半萜内酯类、三萜、山莴苣苦素、莴苣苦素等[4,5], 70%(CG-Ⅱ)乙醇提取物中主要有黄酮、香豆素类及生物碱等, 水提取物(CG-Ⅳ)中主要有有机酸及糖类等[6].为了阐明毛菊苣的药效物质基础, 根据文献[7,8]作者对毛菊苣的根进行了药材有效部位的提取、分离与动物体内活性验证实验等一系列的研究.本实验的主要目的在于评价毛菊苣根95%、70%、50%的乙醇提取物及其水提取物对肝纤维化小鼠的影响, 比较获得相对更加有效的提取物, 为毛菊苣生物活性成分研究以及新药的研究与开发提供科学依据.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物: 清洁级KM小鼠,♂, 体重20 g± 2 g, 购自新疆医科大学动物中心新医动字SYXK(新)2012-0001.标准饲料, 自由饮水.

1.1.2 药品与试剂: 四氯化碳(CCl4, 分析纯), 甲醛(HCHO, 分析纯), 植物油(市售大豆油, 中粮食品营销有限公司), 0.9%NaCl生理盐水, 蒸馏水, CG-Ⅰ、CG-Ⅱ、CG-Ⅲ与CG-Ⅳ(实验室自制, 根据人体剂量换算给药),水飞蓟宾胶囊(天津天士力制药股份有限公司, 生产批号: 150511), 谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)(生产批号: 20151224); 谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)(生产批号: 20151223); 肝组织碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)(生产批号: 20151231);乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)(生产批号:20150113); 谷光甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)(生产批号: 20151221); 考马斯亮兰蛋白试剂盒(生产批号: 20151227), 试剂盒均购于南京建成生物工程研究所.

1.1.3 仪器与设备: TDL-50型台式离心机(上海安亭科学仪器厂制造), TS-8型旋涡混匀器(江苏海门其林医用仪器厂), FA210B电子天平(上海精密科学仪器有限公司),电热恒温水浴锅(北京长安科学仪器厂), 多功能酶标仪(Thermo 3001), Optima TM MAX-XP超速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特公司).

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理: 清洁级KM小鼠70只,♂, 随机分为7组, 每组10只.分别为空白对照组、模型组、阳性药物组(200 mg/kg)和药物治疗组(CG-Ⅰ 150 mg/kg、CG-Ⅱ 150 mg/kg、CG-Ⅲ 150 mg/kg和CG-Ⅳ 150 mg/kg).自造模之日起, 除空白对照组外, 其余各组背部皮下注射20% CCl4植物油溶液10 mL/kg, 2次/wk, 持续6 wk.从第7周开始, 除空白对照组、模型组给予蒸馏水外, 其他各组动物给予相应剂量的提取物灌胃, 每日一次, 持续8 wk.末次给药2 h后, 小鼠摘眼球取血, 并颈部脱臼处死,解剖取肝脏、脾脏组织.

1.2.2 生化指标测定: 小鼠摘眼球取血后处死, 取肝脏、脾脏, 称重, 计算肝脏、脾脏系数.试剂盒检测血清中ALT、AST的活性.肝组织反复匀浆3次制成10%的组织匀浆, 使用冷冻离心机4 ℃, 3500 r/min, 离心10 min, 取上清液, 测定肝组织中AKP、LDH、GSH-Px的活性.

1.2.3 肝组织HE染色石蜡包埋切片: 取小鼠的肝组织,用10%甲醛溶液固定, 石蜡包埋切片, 厚度约1 μm, HE染色后观察组织病理变化.

1.2.4 肝组织Masson染色石蜡包埋切片: 小鼠肝组织石蜡包埋后切片厚度约1 μm, Masson染色后观察组织病理变化.

统计学处理数据以mean±SD表示, 应用SPSS 17.0统计软件进行分析, 比较采用单因素方差分析, 组间比较采用LSD法,P＜0.05表示差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 对肝脏、脾脏系数的影响 模型组小鼠与空白对照组相比, 肝脏系数明显增加, 具有极显著性差异(P＜0.01), 脾脏系数虽有增加的趋势, 但不具有显著性差异(P＞0.05), 说明造模比较成功.药物治疗组与模型组比较, 毛菊苣提取物均可降低肝脏系数, 但其差异无统计学意义; CG-Ⅲ组可以显著降低脾脏系数(P＜0.05)(表1).

2.2 对血清AST、ALT活性的影响 模型组小鼠与空白对照组相比, 血清中的AST、ALT活性显著升高(P＜0.01).药物治疗组与模型组比较, 各组均可降低小鼠血清AST、ALT的活性, 且具有极显著性差异(P＜0.01),结果见表2.

2.3 对肝组织AKP、LDH、GSH-Px含量的影响 模型组与空白对照组比较, 肝组织中GSH-Px含量降低, 具有极显著性差异(P＜0.01), 而AKP与LDH的活性升高, 具极显著性差异(P＞0.05).与模型组比较, 药物治疗组除了CG-Ⅲ组均可以升高小鼠肝组织GSH-Px含量(P＜0.01或P＜0.05), 具有显著性差异.药物治疗组CG-Ⅰ和CG-Ⅱ对小鼠肝组织AKP、LDH含量有降低的趋势, 具有极显著性差异(P＜0.01), 结果见表3.

2.4 组织病理学检查

2.4.1 HE染色: 空白对照组小鼠肝窦及汇管区无异常,肝小叶较完整, 肝索排列规则[9,10], 肝细胞及细胞核相对比较完整(图1A).模型组小鼠肝小叶分割明显, 肝窦不明显, 肝细胞呈气球样变性, 有大量的炎细胞浸润[11,12],胞质疏松(图1B).阳性药对照组与模型组比较, 肝索排列较规则, 肝细胞的胞质均匀, 炎细胞浸润显著减少(图1C).药物治疗组对CCl4所致小鼠酒精性肝纤维化的病理改变均具有恢复作用, CG-Ⅰ和CG-Ⅱ肝小叶分割显著减轻, 肝窦明显, 气球样变性显著减少, 炎性细胞浸润减轻(图1).

2.4.2 Masson染色: 空白对照组小鼠的肝组织正常, 无胶原纤维增生, 组织结构正常(图2A).模型组肝组织与空白对照组比较, 胶原纤维增多, 形成胶原沉积, 破坏正常肝小叶结构, 纤维结缔组织增生进入肝小叶达中央静脉周围(图2B), 说明造模成功[13,14].阳性药对照组与模型组比较, 胶原纤维从汇管区周围向外轻度延伸(图2C).药物治疗组与模型组比较, 减少胶原纤维向外延伸, 无假肝小叶形成.表明毛菊苣提取物对小鼠肝纤维化具有保护作用(图2D-G).

3 讨论

肝纤维化是肝脏中纤维结缔组织的长期沉积进而发展形成的.CCl4是实验研究中常用的化学诱导剂, 其通过脂质过氧化导致细胞损伤, 长时间刺激到一定程度后形成实验性肝纤维化, 该造模方法比较成熟, 常被用于实验动物肝纤维化模型中.实验中所用阳性药为水飞蓟宾胶囊, 其有效成分水飞蓟宾为临床使用保肝药物.本实验中, 小鼠经过造模后, 表现出了肝纤维化的症状, 而CG-Ⅲ组即50%乙醇提取物可以降低脾脏系数, 对肝纤维化小鼠的肝、脾肿胀有一定抑制作用; 肝纤维化形成意味着细胞损伤, 肝细胞质及线粒体中的ALT、AST释放入血, 而药物治疗组均可使肝纤维化模型小鼠血清中的AST、ALT水平显著降低, 从而实现保肝作用, 根据肝组织中AKP、LDH、GSH-Px含量的变化趋势, 可以初步判断, CG-Ⅰ组和CG-Ⅱ组相较于模型组都有相当大程度的改善, 可以看出其具有抗氧化活性, 并且可能通过这一途径来起到抗肝纤维化的作用; 病检结果可以看出药物治疗组小鼠的肝细胞变性、坏死和肝纤维化明显减轻, 说明毛菊苣提取物对小鼠肝纤维化有一定的防治作用.CG-Ⅰ组和CG-Ⅱ组对肝纤维化小鼠的肝小叶分割减轻尤其显著.

表1 毛菊苣对肝纤维化小鼠肝脏、脾脏系数的影响(mean±SD, n = 10)

表2 毛菊苣对肝纤维化小鼠血清AST、ALT活性的影响(mean±SD, n = 10)

表3 毛菊苣对肝纤维化小鼠肝组织的AKP、LDH、GSH-Px含量的影响(mean±SD, n = 10)

图1 各组小鼠肝纤维化病理变化(HE×200, 1:100 μm).A:空白对照组; B:模型组; C:阳性药物组; D:CG-Ⅰ组; E:CG-Ⅱ组; F:CG-Ⅲ组; G:CG-Ⅵ组.

图2 各组小鼠肝纤维化病理变化(Masson×200, 1:100 μm).A:空白对照组; B:模型组; C:阳性药物组; D:CG-Ⅰ组; E:CG-Ⅱ组; F:CG-Ⅲ组;G:CG-Ⅵ组.

综上所述, 通过对毛菊苣根的95%、70%、50%乙醇提取物与水提取物对小鼠肝纤维化的防治作用研究, 表明维药毛菊苣确有保肝作用, 相比较而言,CG-Ⅰ组和CG-Ⅱ组即95%和70%乙醇提取物组的治疗效果最佳, 该提取物主要含有倍半萜内酯、三萜类、黄酮和香豆素等化合物[15], 该研究分析比较了毛菊苣不同提取物在体内动物实验层面的效用, 从结果可以初步判定, 毛菊苣醇提物中的成分对于肝纤维化具有良好改善作用, 这对我们课题组后期对毛菊苣的活性成分及其对肝纤维化治疗的作用机制奠定了物质、理论基础.

文章亮点

实验背景

洗衣疗法对于肝纤维化的治疗具有很多的副作用, 所以现代治疗倾向于中医药, 治疗肝纤维化的方法主要分为两种, 一种是针对于病因, 另外就是专注于肝纤维化形成本身的治疗.毛菊苣作为新疆特色中药, 研究其保肝机制有益于更好的解释、推广其保肝疗效, 对于肝脏疾病的治疗领域来说, 是更深一步的探索.

实验动机

本文探究了毛菊苣不同溶剂及不同溶剂浓度提取物对化学诱导剂引起的小鼠肝纤维化的治疗作用, 通过比较得到疗效最好的粗提物, 为后期进一步研究其发挥作用的成分及发挥作用的机制提供理论基础.

实验目标

本篇论文研究主要目标是确定毛菊苣抗肝纤维化的作用以及有效成分所在部位, 初步确定其保肝机制.研究结果表明, 毛菊苣保肝活性主要体现在其95%、70%醇提物中, 而其保肝机制初步判定可能为抗脂质过氧化.研究达到预期目标, 研究结果对课题组深入研究其保肝机制有重大意义.

实验方法

为实现本文预期目标, 过程中进行动物实验, 通过试剂盒、H&E染色、MASSON染色进行生化及组织病理学分析, 用SPASS进行数据处理.其中CCl4背部皮下注射是经典的造肝纤维化模型的方法, 该方法能相当程度上体现临床患者肝纤维化的各项临床表现, 符合试验目的, 贴合实验要求.

实验结果

毛菊苣醇提物及水提物对CCl4引起的肝纤维化具有一定的逆转作用, 能够抑制肝脏肿胀度, 降低肝细胞损伤引起的谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肝组织碱性磷酸酶及乳酸脱氢酶的升高, 降低谷光甘肽过氧化物酶的水平, 从病理切片可以看出毛菊苣能够减轻肝脏气球样变性, 减少炎症浸润, 治疗组相较于模型组, 肝小叶也更完整, 趋近于正常肝组织切片状态.

实验结论

本文是首次对比毛菊苣不同溶剂提取物抗小鼠肝纤维化的活性, 对抗肝纤维化动物实验效果对比, 从给药成分的不同这个角度缩小了毛菊苣抗肝纤维化的有效成分的范围, 对毛菊苣在肝纤维化治疗方面的成分不明确这一传统中药成见的打破是有效的铺垫.文章结论对未来临床用药具有借鉴意义.

展望前景

随着现代中医药的发展, 中药治疗各种疾病的优势渐渐突出, 但始终存在有效成分不明确的现象, 而限制中药的推广使用, 本实验研究希望通过动物实验明确有效成分所在部位, 确定有效成分及其作用机制将是本课题组下一步重点研究方向.