SH2B1沉默对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT通路的影响

陈烈欢,程龙庆,彭 翔,周永辉,李 泳,高亚南,黄上嘉

广东省佛山市第一人民医院胃肠外二科,广东佛山 528000

胃癌是人类最常见的癌症之一，其发病率和病死率在我国的恶性肿瘤排名均居于第2位[1]。因胃癌早期症状不明显，大部分患者在就诊时已处于胃癌晚期，无法进行手术根除治疗。目前，胃癌的具体发病机制尚不明确，有研究发现，可能与幽门螺杆菌感染、吸烟饮酒等不良生活习惯、遗传因素等有关[2]。另有研究表明，胃癌的发生和发展与多条信号通路有关，其中3-磷酸肌醇激酶(PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT)作为经典的信号通路，在胃癌的发生和发展中发挥着重要作用[3]。SH2B1是SH2B家族成员，包含二聚体化功能域(DD)及血小板C激酶底物同源性结构域(PH)、SRC同源结构域(SH2)。在机体生长发育、免疫调节方面起调控作用。有研究显示，SH2B1蛋白可参与血糖平衡调节，且与超重、肥胖及相关代谢指标具有相关性[4]。近年来研究显示，SH2B1基因在非小细胞肺癌等恶性肿瘤组织中高表达，表明其可能与癌症发生有关[5]。ZHANG等[6]报道，SH2B1高表达可能会大大增加胃癌的患病风险。本研究以胃癌SGC-7901细胞为研究对象，利用siRNA干扰技术研究沉默SH2B1基因后，探究SH2B1基因对SGC-7901细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT通路的影响，旨在为进一步研究胃癌的发生和发展机制提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞株来源 胃癌SGC-7901细胞株购自中科院上海细胞库。

1.2主要试剂 RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司；Trizol抽提试剂、逆转录试剂盒、荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)相关试剂均购自BioRad公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司；青霉素-链霉素溶液，细胞计数试剂盒(CCK-8)、Annexin V-FITC的试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；本研究所使用抗体均购自Abcam公司，本研究中使用的siRNA由GenePharma公司合成。

1.3方法

1.3.1细胞培养 将解冻后的胃癌SGC-7901细胞在37 ℃、5%CO2、湿度为95%的培养箱内培养，培养液为含有10%胎牛血清及双抗的RPMI1640培养基，每3 d换液一次，待细胞生长密度达到80%时，胰蛋白酶消化，根据实验需要进行传代培养，收集对数生长期细胞用于后续研究。

1.3.2细胞转染及qRT-PCR检测 收集对数生长期的细胞接种于6孔细胞板上(5.0×104个/孔)，利用Lipofectamine 2000转染法转染胃癌SGC-7901细胞，操作严格按照试剂盒说明书进行。实验分组：将SH2B1-siRNA转染组作为研究组，将采用国际通用的与所有基因均无同源序列的non-target siRNA转染组作为阴性对照组(NC组)，以未经处理的胃癌SGC-7901细胞为空白对照组(BC组)。各组细胞均接种于24孔板(1.0×106个/mL)，转染试剂与siRNA在培养基(不含血清)中混匀，加入细胞后，避光转染培养6 h，48 h后收集各组转染成功细胞，提取总RNA，利用反转录试剂盒反转录，获得cDNA后利用qRT-PCR试剂盒检测各组细胞中SH2B1 mRNA表达情况。内参基因为β-actin,反应条件如下：预变性94 ℃ 30 s；变性59.5 ℃ 30 s，退火72 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 5 min，共进行30个循环。引物序列见表1。同时利用蛋白质印迹法(Western Blot)检测各组细胞SH2B1 mRNA表达情况。

表1 qRT-PCR引物

1.3.3细胞增殖情况检测 取1.3.2中转染成功的对数生长期细胞分别接种至96孔板(5.0×104个/孔)，每组设置6个复孔，继续培养48 h，分别于0、12、24、36、48、60、72 h时加入CCK-8试剂，继续培养2 h，按照CCK-8试剂盒说明书进行操作，以空白孔调零，利用酶标仪检测490 nm波长下各孔细胞吸光度值(A)。

1.3.4平板细胞克隆形成实验检测SGC-7901细胞增殖情况 取1.3.2中转染成功的对数生长期SGC-7901细胞，胰蛋白酶消化、重悬，梯度稀释后接种至含RPMI1640培养基的培养皿中(1 000个/皿)，移液器吹打分散均匀，置于培养箱常规培养，待出现肉眼可见克隆后，弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，4%多聚甲醛固定，0.5%结晶紫染色，20 min后，清洗染色液，空气干燥。计算3组细胞克隆形成率。克隆形成率=形成克隆数目/接种细胞数目×100%。

1.3.5细胞凋亡情况检测 收集转染后的细胞，胰蛋白酶消化，接种于96孔板(5.0×104个/孔)培养，48 h后收集细胞，利用预冷的PBS洗涤细胞，4 ℃离心后重悬，加入PI及Annexin-V-FITC混合均匀，37 ℃反应20 min，加入结合缓冲液，上机检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.3.6Western Blot检测相关蛋白表达情况 收集转染成功后培养48 h的各组细胞，提取细胞中总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，后转膜，利用Western Blot检测细胞中Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)、Caspase-9、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达情况。

2 结 果

2.1细胞中SH2B1蛋白及mRNA表达情况 转染后，研究组SGC-7901细胞SH2B1蛋白及mRNA表达量较BC组和NC组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

注:A为SGC-7901细胞SH2B1 mRNA表达情况；B为SGC-7901细胞SH2B1蛋白表达情况；与BC组比较,*P<0.05；与NC组比较,#P<0.05,GAPDH是指内参基因。

图1 SH2B1蛋白及mRNA表达情况

2.2CKK-8法检测细胞增殖结果 转染后，研究组SGC-7901细胞增殖随传代培养时间的延长而明显受到抑制，同时与BC组和NC组相比，传代培养进行24 h后，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

注:与BC组比较,*P<0.05；与NC组比较,#P<0.05。

图2细胞增殖情况

2.3平板克隆检测结果 研究组SGC-7901细胞平板克隆形成率明显低于BC组和NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

注:与BC组比较,*P<0.05；与NC组比较,#P<0.05。

图3平板克隆检测结果

2.4细胞凋亡检测结果 转染后，研究组SGC-7901细胞凋亡率较BC组和NC组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

注:A为BC组SGC-7901细胞凋亡情况；B为NC组SGC-7901细胞凋亡情况；C为研究组SGC-7901细胞凋亡情况；D为3组细胞凋亡情况柱状图。图A、B、C横、纵坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度。与BC组比较,*P<0.05；与NC组比较,#P<0.05。

图4细胞凋亡情况

2.5增殖及凋亡相关蛋白表达情况 与BC组和NC组比较，研究组SGC-7901细胞Ki67及PCNA蛋白呈低表达,Caspase-9蛋白呈高表达，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 增殖及凋亡相关蛋白表达情况

注：与BC组比较，*P<0.05；与NC组比较，#P<0.05。

2.6PI3K/ATK信号通路相关蛋白表达情况 与BC组和NC组比较，研究组SGC-7901细胞PI3K及p-AKT蛋白呈低表达，差异均有统计学意义(P<0.05);AKT蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 PI3K/ATK信号通路相关蛋白表达情况

注：与BC组比较，*P<0.05；与NC组比较，#P<0.05。

3 讨 论

胃癌是严重威胁人民生命健康的恶性肿瘤之一，近年来，其病死率逐渐升高。胃癌的发病机制尚不完全清楚，可能与遗传、不良生活习惯等有关。胃癌发病较为隐匿且具有侵袭性，多数患者就诊时已处于晚期，错过了最佳治疗时期，因此，研究胃癌的发病机制，寻找靶向治疗的方法对于延长患者生存时期、提高生存质量具有重要意义。

SH2B家族是一类信号受体蛋白，在机体生长发育、代谢平衡方面发挥重要调控作用。SH2B1蛋白是原癌基因Shc的表达产物。SH2B1可通过SH2结构域与受体激酶或受体结合，从而形成蛋白复合物进行细胞信号传导。研究显示，脑中SH2B1基因可控制机体代谢，与肥胖有关，能通过调节JAK2、IRS1等影响酪氨酸酶活性的信号转导途径而调节机体能量代谢[7]。另有研究表明，SH2B1高表达是胃癌发生的独立危险因素[8]。siRNA可特异且高效地沉默内源基因表达，因此常被用于研究基因功能[9]。本研究采用siRNA靶向沉默SH2B1基因，结果显示，研究组细胞SH2B1蛋白及mRNA表达量较BC组和NC组均明显降低，提示siRNA转染胃癌SGC-7901细胞后可抑制SH2B1基因表达。

癌症的发生及发展与肿瘤细胞的增殖和凋亡失衡有关。细胞凋亡是由一系列基因级联控制的细胞自我消亡，细胞增殖也是由细胞内基因调控的[10]。其中CCK-8检测法是检测细胞增殖情况的常用方法。CCK-8试剂中含有四唑盐WST-8成分，受细胞线粒体中脱氢酶的影响，被还原成具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，其数量与活细胞数量呈正比，利用酶标仪测定490 nm波长下吸光度值，由于吸光度值、活细胞数量与增殖能力呈正比，可借此对细胞增殖情况进行分析[11]。本研究检测结果显示，与BC组和NC组比较，研究组SGC-7901细胞增殖率、平板克隆形成率降低，凋亡率升高，提示沉默SH2B1基因表达可抑制SGC-7901细胞增殖。Ki67及PCNA与细胞增殖密切相关，Ki67是常见的增殖细胞标志物，PCNA只存在于正常细胞及增殖细胞内，是细胞异常增殖的关键蛋白[12-13]。Caspase-9是细胞凋亡的启动者和效应者，其水平变化可反映细胞凋亡情况。本研究结果显示，与BC组和NC组比较，研究组SGC-7901细胞Ki67、PCNA蛋白低表达，Caspase-9高表达，进一步证实沉默SH2B1基因表达可抑制SGC-7901细胞增殖，促进凋亡。

已有研究表明，PI3K/AKT信号通路在乳腺癌[14]、子宫内膜癌[15]等多种肿瘤中失调，主要表现为PI3K过表达和AKT过度活化。PI3K含有p85和p110两部分，其中p85羧基端有SH2结构域，p85与p110在SH2区结合，AKT是PI3K/AKT信号转导通路的中枢，其活化程度与肿瘤进展有关[16]。AKT共含有3个亚基：N端的PH结构域，中间的激酶/催化结构域，C端的调节结构域，其中PH结构域可介导AKT进行膜转位，进而激活AKT。PI3K可激活下游靶点AKT，通过磷酸化作用使其转化为p-AKT，进而激活或抑制下游基因表达，介导细胞增殖、凋亡。研究显示，p-AKT可磷酸化Caspase-9基因的196位丝氨酸位点，抑制其促凋亡作用[17]。在本研究中，研究组SGC-7901细胞PI3K、p-ATK蛋白较BC组和NC组低表达，AKT蛋白差异无统计学意义(P>0.05)，提示沉默SH2B1基因后，细胞可能通过抑制PI3K表达进而抑制ATK蛋白磷酸化。SHIH等[13]研究显示，过表达SH2B1基因可增强PI3K/ATK信号通路活化，本研究推测，SH2B1基因沉默后可能通过抑制PI3K/ATK信号通路激活，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。

综上所述，沉默SH2B1基因表达可能通过抑制PI3K/ATK信号通路激活，抑制SGC-7901细胞增殖，达到促进凋亡的效果。该研究为胃癌的靶向治疗提供了一定理论基础。