循环肿瘤DNA在肾细胞癌中的应用研究进展

师 越，董 冬

（天津医科大学肿瘤医院检验科 国家肿瘤临床医学研究中心 天津市“肿瘤防治”重点实验室天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津 300060）

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是全球第七大最常见癌症，占全世界成人恶性肿瘤的2.4%，且发病率呈逐年上升趋势[1]。目前，RCC的诊断主要依赖影像学和病理学检查。但是这些检查方法均具有明显缺点：影像学检查虽然可以检测到肾脏的占位性病变，但不足以判断病变的组织学类型；组织病理学检查属有创性检查，需要有严格的医学指征。此外，影像学和病理学检查在评估肿瘤的转移风险和疾病的进展，以及在监测肿瘤疗效方面均没有太大的应用价值。同其他实体肿瘤不同，目前RCC尚未发现可适用于临床的肿瘤标志物，故不利于对高危人群的筛查和疾病的早期诊断。

由于早期RCC缺乏临床症状，30%的患者被诊断时已是疾病中晚期。晚期RCC患者的预后普遍较差，5年总生存率仅为8%[2]。此外，在接受根治性肾切除术后，超过30%的RCC会复发或转移[2]。在过去的几年中，针对晚期或转移性肾细胞癌（metastatic renal cell carcinoma，mRCC）患者的治疗策略发展迅速。例如，免疫疗法[抗程序性细胞死亡1（programmed death-1，PD-1）抗体纳武单抗和抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4抗体伊匹单抗][3]、蛋白酶抑制剂[哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制剂依维莫司][4]以及酪氨酸激酶抑制剂（舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼和阿西替尼）[5]，均可以使晚期RCC或mRCC患者显著获益。然而，这些治疗措施均需要一定的免疫学或分子生物学指征，药物的耐受仍是限制疗效的关键问题。在这种情况下，迫切需要针对RCC可靠且无创的生物标志物，以进行疾病早期诊断，指导靶向药物的选择，监测治疗效果，发现并评估药物耐受情况，以便及时调整治疗方案。

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是存在于血液或体液中由肿瘤细胞衍生出的片段化DNA，是一种特征性的肿瘤生物标志物。通过分析ctDNA的各项特征，可获得与该肿瘤相关的多方面信息。ctDNA检测的核心优势在于其能反映整个肿瘤基因组的信息[6-7]，而且具有实时性、易获得性。因此，近年来在抗击癌症中的应用价值受到了极大的关注，但ctDNA在RCC临床诊治中的应用仍处于探索的早期阶段。深入研究其临床应用价值对各个阶段的RCC患者均有益，并有助于提供个性化的mRCC治疗方案。本综述对ctDNA在RCC诊断、预后评估、疾病复发监测、治疗效果监测及获得性耐药等方面的临床研究进展进行介绍。

1 ctDNA含量与片段化

先抛开序列信息不谈，RCC患者外周血中ctDNA的含量和片段大小本身就具有一定的临床应用价值。有研究发现，mRCC患者外周血中ctDNA的含量与肿瘤负荷相关，在53%的mRCC患者外周血中检测到了ctDNA，这些患者的肿瘤体积显著大于未检测到ctDNA的患者[8]。WAN等[9]的研究则进一步证实，血浆ctDNA的水平与RCC的复发相关，肾切除术前血浆ctDNA水平高的患者肿瘤复发率明显高于血浆ctDNA水平低的患者。ctDNA的水平在治疗监测中同样具有重要作用，FENG等[10]在不同时间点对18例接受索拉非尼治疗的mRCC患者血浆ctDNA水平进行定量检测，发现在治疗过程中血浆ctDNA水平与预后呈负相关。

YAMAMOTO等[11]进行了更为深入的研究，发现RCC患者血浆中ctDNA中位数水平要显著高于健康对照组。此外，血浆ctDNA的水平随着肿瘤TNM分期和Fuhrman分级的增高而增加；伴有淋巴管浸润患者的ctDNA水平也显著高于不伴浸润的患者；与健康对照组相比，即便是早期（cT1aN0M0）RCC患者，其血浆ctDNA水平也会显著升高。该研究团队还揭示了ctDNA的片段化水平同样具有临床应用价值，即RCC患者血浆ctDNA片段长度要显著短于健康对照组，而且ctDNA片段大小与RCC患者的疾病无进展生存率呈负相关[11]。不仅如此，在较高的Fuhrman分级和淋巴管浸润阳性的患者中，ctDNA的平均长度更短[11-12]。以上这些研究结果均提示，ctDNA的含量及片段化水平对于RCC患者的诊断、疾病分期和分级，以及预后判断均具有重要的潜在价值。

2 ctDNA的突变

ctDNA来源于基因组DNA，其所携带的碱基突变数量与患者肿瘤细胞的突变负荷直接相关，检测ctDNA的突变谱有助于预测患者是否能够从免疫学检查点抑制剂治疗中获益[13]。纳武单抗是一种针对PD-1的单克隆抗体，最近被批准用于治疗伴有错配修复缺陷的恶性肿瘤[14]，而mRCC属于其治疗适应症。目前，免疫检查点抑制剂在mRCC的治疗中起着极其重要的作用，并且预计在不久的将来会有越来越多的相关药物被批准用于mRCC的治疗。此外，多种免疫学检查点抑制剂的联合使用有望成为mRCC的一线疗法[15-17]。ctDNA中碱基突变数量可以预测RCC患者对免疫治疗的反应，这更显示出了ctDNA突变检测所具有的临床应用价值。

除此之外，RCC的突变特征也与治疗应答和疗效密切相关。有研究发现，RCC小鼠血浆中可检测到带有耐甲氧戊二烯（methoprenetolerant，MET）突变的ctDNA，其水平与原发肿瘤的体积相关，并随着卡博替尼的治疗而改变[18]。血管内皮生长因子受体1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）基因上的rs9582036突变能够预测舒尼替尼治疗的效果，有望成为一个重要的预测生物标志物[19]。PAL等[20]检测了220例mRCC患者的ctDNA突变谱并进行分类，评估不同ctDNA突变类型患者对靶向治疗的反应性是否存在显著差异，发现ctDNA中p53基因突变水平的升高与舒尼替尼、帕唑帕尼及贝伐珠单抗等靶向药物的耐药产生相关。

由肿瘤异质性引起的耐药性是限制肿瘤治疗效果的根本原因，RCC也不例外[21]。在肿瘤组织中，哪怕只有极少数的癌细胞带有耐药突变，那么在治疗过程中，这些细胞都可能存活下来，进而形成耐药肿瘤组织[22]。这些肿瘤细胞在最初的病理活检中会因数量少或空间分布等原因而被漏检，ctDNA可以提供更具代表性的肿瘤遗传多样性“全视图”，从而可以在一定程度上弥补这个缺憾，这对指导RCC的治疗决策具有重要意义。

3 ctDNA甲基化

ctDNA甲基化标志物已成为肿瘤临床治疗研究的热点，这不只是因为甲基化改变是肿瘤发生的一个早期而独立的事件，更是因为外周血ctDNA的甲基化图谱恰似肿瘤细胞的指纹，具有高度的肿瘤特异性和个体特异性。由Epigenomics公司研发的外周血Sept9甲基化检测试剂盒已经获得美国食品与药品监督管理局批准上市，用于结直肠癌的筛查和早期诊断，并且在肿瘤复发监测、预后判断，以及治疗监测中均具有重要的临床应用价值[23-24]。

ctDNA甲基化已成为多种肿瘤诊断和预后评估的非常有前途的表观遗传标志物，对RCC来说亦是如此。大量研究结果表明，DNA甲基化参与RCC的发生和发展，并且能够反映患者对治疗的反应性[25-26]。DNA甲基化通常发生在癌症的早期，这使DNA甲基化生物标志物成为早期检测的理想靶标。SKRYPKINA等[27]的研究发现，RCC患者血浆DNA中可以检测到Ras区相关域家族1A（ras association domain family 1A，RASSF1A）、脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad，FHIT）和结肠腺瘤样息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）的甲基化，对于RCC的诊断具有重要价值。此外，DNA甲基化通常与治疗药物的耐药性和敏感性有关。因此，甲基化生物标志物既适用于在药物治疗前对患者进行有效性分层，也适用于在治疗过程中监测疾病的进展。

JUNG等[28]检测了RCC组织及血浆样品中身材矮小同源盒蛋白2（short stature homeobox protein 2，SHOX2）的甲基化水平，并对其临床意义进行了评估，发现通过检测治疗前ctDNA中SHOX2甲基化水平可以鉴别出肾切除术后仍具有高死亡风险的RCC患者，通过早期干预，这些患者可能受益于辅助治疗或早期进行的姑息治疗。另一项研究发现，血清中原钙黏蛋白17（protocadherin-17 precursor，PCDH17）甲基化是RCC中的常见事件，并能够提示预后不良，有可能成为术后RCC患者预后的生物标志物[29]。除了血液样本，RCC患者尿液样本中的PCDH17甲基化也有可能成为泌尿系统肿瘤的生物标志物，包括膀胱癌、RCC和前列腺癌[30]。在RCC患者尿液样本中挖掘出的另一种甲基化生物标志物是转录因子21（transcription factor 21，TCF21），该基因在RCC患者尿液中的水平与其在肿瘤组织中的水平呈正相关，且对RCC具有一定诊断价值[31]。COSTA等[30]的研究进一步印证了这一结论。事实上，在组织学水平上，很多基因的甲基化水平与肾癌患者的预后紧密相关，但是这些基因在血浆中的甲基化水平是否也与肾癌患者的预后相关还有待深入研究。理论上特定基因在肿瘤组织中的甲基化水平应该与血浆或者尿液中的水平是一致或相关的[31]，这些基因在外周血或尿液中的甲基化水平在疾病预后中的临床价值也应该得到关注。

4 其他

4.1 多态性

自噬在RCC的发生及进展中发挥了重要的调控作用。SANTONI等[32]对外周血中自噬基因的基因型进行了分析，以评估其与肾透明细胞癌患病风险以及预后的相关性。他们选取的自噬相关基因包括自噬相关家族基因（autophagyrelated gene，ATG）中的ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG5、ATG16L1、ATG16L2和IRGM，并在40例接受帕唑帕尼治疗的mRCC患者中对这些基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）进行分析，发现与普通人群相比，mRCC患者ATG16L2-rs10751215的发生率显著降低，ATG4A-rs7880351、ATG4C-rs6670694和ATG5-rs490010与接受帕唑帕尼的治疗RCC患者的疾病无进展生存期相关。

4.2 线粒体

LU等[33]调查了基因组和线粒体来源的ctDNA片段在RCC患者诊断和预后中的应用潜力，他们从40名健康对照者和229例RCC患者（145例RCC和84例mRCC）中提取ctDNA并进行分析，发现2个线粒体片段（65 bp和175 bp）能够将健康对照者、RCC和mRCC患者进行有效的区分；同时还发现，有1个基因组ctDNA片段（306 bp）能够对RCC患者和健康对照者进行区分。该研究表结果明，基因组和线粒体ctDNA片段可能有助于早期诊断mRCC，这在RCC辅助治疗中可能具有重要的应用价值。

5 问题与展望

RCC患者外周血ctDNA有其自身特点，与其他实体瘤（如胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌等）相比，RCC患者的ctDNA水平相对较低[34-35]。RCC患者的ctDNA水平与疾病进展相关，具有高肿瘤负荷的RCC患者倾向于具有更高水平的ctDNA[34]。而对于早期RCC患者来说，需要具有更高灵敏度的检测方法进行检测。

作为液体活检的一个重要分支，ctDNA检测具有改变癌症治疗前景的潜力。但是，这种新方法的广泛使用仍面临着诸多挑战，包括：如何改进技术以提高早期RCC患者外周血中ctDNA检测的敏感性和特异性；如何制定统一、规范的操作流程以使不同实验室的检测结果具有可比性；如何降低检测成本以使该检测适用于疾病的早期筛查。作为肿瘤诊断的金标准，组织病理检查仍具有不可替代的作用。随着研究的深入，ctDNA检测在RCC诊断、预后评估、疾病复发监测、治疗效果监测及获得性耐药等方面的作用日益受到重视。作为一种非侵入性的检测方法，ctDNA检测能够使患者容易耐受，并能够满足临床对于实时性和连续性取材的要求。因此，ctDNA检测将可能成为组织活检不可或缺的补充手段，其临床应用价值得期待。