血浆ctDNA检测在结直肠癌诊疗中的应用

陈馨宁，邬升超，郭 玮，王蓓丽

（复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032）

结直肠癌全球发病率和死亡率分别居第3位和第4位[1]。结直肠癌的发生、发展被认为是由环境因素以及遗传学和表观遗传学的积累所导致的[2]。常见结直肠癌治疗方式有手术切除、放疗、化疗以及分子靶向治疗[3]。在常见治疗手段中，分子靶向治疗由于其较低的毒性反应、更强的靶向性、更好的疗效，在结直肠癌治疗中获得更多关注。在临床制定治疗策略前，通常推荐对肿瘤原发灶及转移灶进行活检，然而由于受制于取样差异、肿瘤异质性、无法反复多次取样[4]以及其创伤性等缺点，越来越多的研究者将注意力放在了能够弥补组织活检不足的液体活检上[5-7]。

1 液体活检与ctDNA

不同于肿瘤组织活检，液体活检是针对患者体内循环系统的一类非侵入性病理检测方法。液体活检操作简便、无创、实时，可多次实施，具有替代传统活检的潜质[8]。液体活检在未来医学的早期诊断、治疗选择、预后监测、疗程指导等领域都具有巨大的潜力。很多体液，如血液、尿液、脑脊液等都可以作为液体活检的标本，其中从血液中分离出的一系列物质经过分子分析可以得到独特的、补充性的信息[7]。根据诊断标志物种类将液体活检领域进行细分，通常会把液体活检领域划分为3个主要方面：循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）。

ctDNA来自于坏死肿瘤细胞、凋亡肿瘤细胞、循环肿瘤、肿瘤细胞分泌的外泌体[9]。ctDNA带有肿瘤原发灶或转移灶的生物信息（包括突变、重排、甲基化等），血液中的ctDNA数量和性质受到多种因素影响，肿瘤分期越高、负荷越大，ctDNA检出率越高[10-11]。ctDNA片段大小为70～200 bp，通常大于非肿瘤性循环游离DNA，半衰期为16 min～2.5 h。ctDNA可用于监测手术或化疗后癌症患者的肿瘤动态，这种个性化的基因检测方法也普遍适用于其他类型的癌症个体[12]。选择灵敏度和特异性高周转时间较短的液体活检技术，能够使临床医生及时获得可能对患者进行前瞻性或者随访有用的信息[13]。

2 ctDNA的常见检测平台

随着对ctDNA研究热度的不断攀升，各种高灵敏度和高特异性的检测手段被开发出来，使检测低丰度的ctDNA成为可能。目前常见的检测手段有：磁珠乳液扩增法（beads emulsion，amplification and magnetics，BEAMing）、微滴式数字聚合酶链反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）、下一代测序（next-generation sequencing，NGS）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization time of flight，MALDI-TOF）、扩增阻滞突变系统聚合酶链反应（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）等。见表1。

BEAMing是第1种通过临床验证的液体聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）活检技术，其检测结直肠癌患者中RAS突变状态的能力已通过CE认证。BEAMing是将单个独立的DNA分子同油包水乳液中的磁珠相连接，随后进行PCR扩增，然后通过与特定的突变型或野生型荧光等位基因特异性探针杂交来确定与磁珠结合的DNA的突变状态，最后采用流式细胞术来检测存在于血浆中的突变体DNA的水平[8，14]。

ddPCR是将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳米级的微滴，经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度[15]。

NGS是采用边合成边测序的策略将数百万DNA模板同时进行测序，基于大规模平行测序技术，大幅提高了效率，并使成本显著下降[16]。NGS是目前基因研究的主要方法之一，运用NGS进行基因组DNA序列分析和风险预测，在肿瘤研究领域作出了极大贡献[17]。

质谱是一种高特异性和准确性的分析技术，可用于确定原子和分子的质量、分析分子的元素组成、阐明分子的化学结构[18]、通过测定离子飞行时间得到离子的质荷比、检测离子。MALDI-TOF近年来被广泛应用于核酸分子诊断领域，如唐氏综合征筛查、病原体分型检测、肿瘤药物基因突变检测等[19-20]。

ARMS-PCR的基本原理是由于TaqDNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，在一定条件下PCR引物3'末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物，通过PCR直接达到区分突变型和野生型基因的目的[21]。

表1 ctDNA检测方法比对

3 ctDNA在结直肠癌诊疗中的应用

3.1 ctDNA对结直肠癌患者预后评估价值

当前监测结直肠癌复发的方法包括对血液中癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的检测，以及周期性电子计算机断层扫描检查。但是由于前者的低灵敏度、后者的辐射以及成本限制等，术后结直肠癌患者病灶状况未能得到很好的监测[22]。

ctDNA是转移性结肠直肠癌患者治疗过程中颇具前景的生物标志物。有研究结果显示，手术前所有受试者均可检测到ctDNA，血液检测结果显示ctDNA水平的变化与手术切除范围相关。手术后检测出ctDNA的受试者一般在1年内复发。ctDNA可能是一个比目前的标准生物标志物CEA更可靠和敏感的指标[12]，可以提供早期干预的治疗窗口[23]。

2项背靠背发表的基于ctDNA检测微小残留病变（minimal residual disease，MRD）的文献指出，评估Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌患者根治性术后ctDNA的突变情况，能有效预测患者复发风险[11，24]。2项研究都在术后采取了多点取样监测的方式，并比较了不同的监测模式对预测复发风险的准确性，发现术后单点、辅助治疗后单点和综合多点随访监测这3种模式下，ctDNA阳性患者复发风险分别是ctDNA阴性患者的7倍、14倍和40倍，说明多点的ctDNA MRD监测是最有效预测复发风险的方式，准确性远远高于术后单点监测。这是首次有循证医学证据充分证实这个论点，对于后续规范化MRD的临床应用有重要意义。

3.2 ctDNA在结直肠癌个体用药中的应用

结直肠癌细胞主要通过2种策略逃避表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）阻断。第1种耐药机制在43%的患者样本和58.8%的细胞样本中可被检测到[25]。近来更多的证据显示，KRAS第2号外显子以外的突变以及NRAS突变也可以预测患者对西妥昔单抗和帕尼单抗（作用于EGFR的单克隆抗体）的耐药。KRAS基因野生型患者可从抗EGFR单药治疗或联合化疗中获益，但KRAS基因第2号外显子的第12或13位密码子发生突变者不能受益[26]。因此，专家组强烈建议对所有转移性结直肠癌患者进行肿瘤组织（原发瘤或转移灶均可）的KRAS/NRAS基因突变检测。已知KRAS/NRAS突变的患者，均不应接受西妥昔单抗或帕尼单抗治疗，无论单药还是与化疗联合，因为这些患者不但没有机会从治疗中获益，而且还将面临治疗的毒性和费用[27-28]。一项Ⅲ期临床研究对化疗+贝伐珠单抗及化疗+贝伐珠单抗+西妥昔单抗在转移性结直肠癌中一线治疗的疗效进行对比，发现BRAF突变型的患者在这2种治疗中疗效都不好，中位无进展生存时间（progression-free survival，PFS）及总生存期（overall survival，OS）都远低于野生型患者[29]。

第2种耐药机制涉及EGFR细胞外结构域突变，在10.8%的患者样本和29%的细胞中可被检测到[25]。EGFR基因胞外域也发现了与耐药相关的基因突变。V441D和V441GEGFR突变体与野生型EGFR相比，西妥昔单抗和帕尼单抗的结合力显著降低[30]；G465R或G465EEGFR序列突变对受体细胞外部的结构域Ⅲ产生影响且结构分析表明，这些突变可能影响西妥昔单抗的结合[31]；S492REGFR细胞外域突变将干扰西妥昔单抗的结合并且产生抗药性[32]。

综上所述，结直肠癌患者ctDNA的检测和监测对患者预后管理、治疗选择和疗效评估至关重要。ctDNA中检测到的突变状况对制定治疗方案具有启示意义，将ctDNA作为生物标志物是非常有前景的，会使临床和患者受益。因此，需要尽快建立标准化的、可被医生和患者接受的检测方式和结果解读指南。