含有白细胞的富血小板纤维蛋白的生物学特性及临床应用

孙慧颖，朱崇元，冯国栋，高志强*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 耳鼻咽喉科， 北京 100730；2.潍坊医学院 耳鼻咽喉科, 山东 潍坊 261053)

血液制品于40年前开始用在促进组织修复及愈合的临床治疗上，当时主要以纤维蛋白制成的凝胶为主[1]。以后又出现了富含血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)的制备和应用[2]。以此为契机，一系列富血小板的自体血液制品诞生并逐渐广泛应用于临床，但这些血液制品存在着制备过程复杂、造价较高、制备时需添加外源性物质以致排异风险高等问题。随后， 在PRP基础上， 利用自体静脉血制

备了含有白细胞的富血小板纤维蛋白(leucocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF)[3]，这种L-PRF较PRP的优势如下：1)生物学效应更高：①L-PRF中存在的白细胞及细胞因子可起到抗感染及免疫调节的作用，而PRP不含白细胞；②L-PRF的纤维蛋白网更加致密而坚固，更利于长期发挥作用；2)制备更简单；3)不含外源性添加物，安全性更高[4-5]。目前L-PRF在口腔科、整形外科及骨科的临床工作中应用广泛。基于L-PRF具有促进骨组织修复的作用，本研究利用L-PRF联合自体骨粉在耳科手术中修复骨性结构方面做了初步尝试，收效良好。本文总结了L-PRF的生物学特点及临床应用现状，探讨其应用于耳外科手术重建骨性结构及促进软组织修复的可能性。

1 L-PRF的生物学特点及其主要衍生物

第二代富血小板的血液制品L-PRF相比于第一代富血小板的血液制品PRP主要不同点在于纤维蛋白构架以及所含细胞成分比例上。这两点要素决定了血液制品最终的性状，从而限定了其临床应用的范围。

1.1 L-PRF特殊的纤维蛋白网状结构

L-PRF及PRP均具有三维的纤维蛋白网状结构，纤维蛋白网的作用在于：1)网络住血小板或白细胞，使得其能集中、缓慢地在局部释放生长因子及细胞因子；2)有趋化作用：可募集血液及组织中的多种细胞(如成纤维细胞、成骨细胞、脂肪前体细胞等)向其迁移，因可提供支架有利于细胞附着、增殖和分化，在自体血细胞成分释放完之后，仍有外界细胞成分参与并发挥作用，延长了生物学效应的时间[6]。

L-PRF的纤维蛋白网较PRP的更加规则、致密，稳固而不被轻易水解，这使得血小板及白细胞不易扩散到周围组织中，可以在原处缓慢地发挥作用，也更利于募集到的组织细胞附着，作用时间更长。纤维蛋白网的结构取决于凝血酶的含量、制备时的离心速度及纤维蛋白原的含量，具体如下：1)纤维蛋白原在凝血酶的作用下脱去血纤维蛋白肽A和B，彼此连接形成纤维蛋白，纤维蛋白再编织成复杂的纤维蛋白网。低浓度的凝血酶使得纤维蛋白原去蛋白肽的速度慢，可配合原纤维横向及纵向增长的速度，最终形成粗壮的纤维网；而高浓度的凝血酶使得纤维蛋白原快速地脱去蛋白肽，在未能加入形成原纤维前，形成许多短小的低聚物而被浪费，因此最终的纤维蛋白网的纤维束较细且连接不稳定，更容易被水解。在此过程中，钙离子对凝血酶起到催化作用。PRP的制作中需要添加凝血酶及钙离子等促凝剂，因此其形成的纤维网不如L-PRF的规则、粗壮及稳定[1]。2)离心速度越快则纤维蛋白越粗壮、网格越致密有序，最终形成的富血小板纤维蛋白体积越大，其内的细胞含量越高；此外，离心机的固有参数(如径向振动、共振频率)亦对纤维蛋白网的形成、尤其细胞的数量有影响[7-9]。L-PRF的制备中需要经过1次离心，而PRP在制备中须经历较L-PRF更低速的2次离心,由此PRP的蛋白网更加松散。3)PRP在第1次离心中弃掉上层血浆中未聚合的纤维蛋白原，导致第2次进行离心时可利用的原材料更少，亦影响了PRP的结构及产量[1]。

综上所述，PRP制备中弃去了一些纤维蛋白原，又由于制备过程中添加的外源性凝血酶及钙离子的作用，纤维蛋白的聚合速度超过生理状态，PRP在相对低速的梯度离心后，最终形成的纤维网络僵硬而缺乏弹性，含有很多较细的小纤维，易被分解吸收，PRP中的生长因子在10 min内会释放70%，1 h内即几乎全部释放，作用时间较短，半衰期5～7 d[10]。而L-PRF无外源性凝血酶等添加剂，弃去的纤维蛋白原相对较少，在相对高速的离心下其形成的纤维蛋白网络更加致密、稳固，不易被水解，从而生长因子得以缓慢释放并发挥生物学作用，可持续7～14 d[11-12]。

1.2 L-PRF的生长因子及细胞因子

L-PRF富含全血中约97%的血小板和50%以上的白细胞，包含许多种细胞因子及生长因子，主要包括转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等[6]。TGF-β1主要由人体血小板在组织损伤时释放，其通过趋化巨噬细胞、成纤维细胞及上皮细胞等，促进胶原合成、血管形成及上皮化，从而加快组织愈合过程。PDGF可由血小板和单核细胞分泌，与间叶组织表达的受体结合，可起到趋化作用并促进有丝分裂，加速纤维化和组织愈合。VEGF可通过调控血管内皮细胞的迁移、增殖和分化，促进新生血管的生成，同时对成骨细胞分化起到刺激作用，在骨修复中起一定作用。 EGF通过刺激角化细胞和皮肤成纤维细胞的增殖，促进表皮再生和创面的愈合，同时对其他生长因子有促进作用。此外，L-PRF内还含有一种重要的细胞基质蛋白——血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)，其对L-PRF微环境的调节起着重要作用，同时TSP-1可与蛋白水解酶竞争vWF结合位点，从而促进凝血过程[13-14]。

L-PRF中所含的白细胞能够释放多种促炎性反应因子，使得L-PRF具有抗感染能力。主要包括：白介素-1B (interleukin-1B，IL-1B)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α)等。这些因子不仅可以调节免疫应答，更具协同发挥作用调控细胞代谢、组织增生的作用。如骨折后通过调节破骨细胞、成骨细胞相互作用促进骨性愈合等[5]。

如前文所述，L-PRF的纤维蛋白网可募集巨噬细胞等组织细胞成分，进一步持续释放生长因子及细胞因子，形成良性循环，延长了L-PRF促进上皮化、新生血管形成及新骨形成等生物学作用的时间，效果较PRP更好。

2 L-PRF的衍生物

为了满足不同的应用需求，在L-PRF的基础上产生了几种L-PRF的衍生物，以下就较常见的两种进行介绍。

2.1 I-PRF简介

可注射的PRF(injectable-platelet-rich fibrin, I-PRF)为液体状,是在700 r/min，离心3 min下制备而成的。短时间的低速离心限制了纤维蛋白网的形成，使血液离心后呈两层状态，底层为以红细胞为主的细胞层，顶层为含血浆、血小板及白细胞的I-PRF层。I-PRF的优势在于其为溶液形态，因此更方便与其他生物材料混合应用；I-PRF中的白细胞及血小板含量更高，因此所含生长因子及细胞因子较PRP及L-PRF更丰富，已有文献证实I-PRF能够更长时间释放生长因子并促进成纤维细胞迁移，在促进新生骨形成及抗菌能力等方面作用更强[15-16]。

2.2 A-PRF简介

改良型富血小板纤维蛋白(advanced platelet-rich fibrin，A-PRF)是在更低速下离心更长时间后获得的(1 500 r/min，14 min)，A-PRF与L-PRF均呈胶冻状，但A-PRF的纤维蛋白网因更加低速及长时间的离心而较L-PRF疏松，血液中的有形成分更易浸润，因此其富含的白细胞及干细胞较L-PRF更多[17]。干细胞在组织修复中具有非常重要的作用，其可分化为多种类型的组织细胞并可通过调控B-和T-淋巴细胞参与免疫调节和细胞调亡。A-PRF可通过在局部组织中提供较L-PRF多的自体干细胞而发挥优势。

I-PRF与A-PRF的临床应用报道有限，其与L-PRF的差别仍有待更多的动物及临床试验明确。

3 L-PRF的制备及注意事项

L-PRF的制备通常使用Choukroun的标准离心方法，通过离心使采集的静脉血分3层，上层为血小板贫乏的血浆(platelet-poor plasma，PPP)，中层为L-PRF，下层为红细胞层(red blood cells, RBCs)。L-PRF的制备要素包括：1)采血后立即离心：因制备过程中无添加物，因此L-PRF需要取静脉血后立即盛入特制的试管中进行离心，否则会产生血凝块导致制备失败；2)离心速度和时间：如前所述，离心的速度和时间会不同程度影响PRF纤维蛋白网的微结构及血小板和白细胞的含量，但目前的制备方法仍有细微差异。PRF的标准离心方法是2 700 r/min，12 min，亦有3 000 r/min 离心10 min[7]，但两种不同离心方法对L-PRF的性状、构成、生物活性等方面的影响，目前研究较少，结果尚有争议；3)其他：多采用干燥和无添加剂的无菌玻璃或塑料试管，L-PRF在常温下离心后立即取出置于挤压盒中1 min，可根据需要压成膜状或小块状备用。制备完成后的L-PRF应立即使用。

4 应用

4.1 L-PRF在口腔科、骨科及整形科的应用现状

L-PRF为自体血液来源，无排异反应，安全性高。且L-PRF具有促进成骨、上皮化及抗感染等作用，已在基础实验及临床应用中得到广泛认可。目前L-PRF主要应用于口腔科、骨科及整形外科的组织修复重建工作中。在口腔科用于：1)作为生物屏障膜修补口腔黏膜病损切除后的黏膜缺损；2)上颌窦底内提升手术中用以促进骨质增生；3)拔牙后局部填塞以保存拔牙位点；4)口腔上颌窦穿通的填补；5)第三磨牙拔除后干糟症的预防及治疗；6)促进年轻恒牙牙髓组织再生等[18-19]。在骨科用于：1)骨缺损的局部修复；2)脊柱融合手术；3)半月板等关节软骨损伤与修复；4)韧带/肌腱损伤的修复；5)预防骨与关节感染[20-22]。在整形科用于：1)慢性创面的修复；2)游离皮片及脂肪移植中促进组织增生及成活等[23-24]。

4.2 L-PRF在耳外科中的应用现状及展望

在耳显微外科学中，骨质缺损的修复、外耳道的重建对于保护重要结构、重建有自洁能力的外耳道、降低感染及胆脂瘤复发率、减轻患者反复复诊的负担等方面有重要的意义。以往常用的填充和重建材料包括自体材料(如骨、软骨和肌肉等)及人工材料(如羟基磷灰石水泥)。自体材料重建血运的时间长，表面覆盖的皮肤、筋膜易萎缩、坏死，导致骨粉、骨片及软骨的泄漏或暴露、感染，引起外耳道及乳突腔的上皮化时间延长，而肌肉瓣可逐渐萎缩，其游离端易缺血坏死而致内陷袋形成，引起感染、上皮堆积，这些情况均限制了自体材料的应用，目前尚没有理想的解决方案。而人工材料因存在感染、排异反应等风险，亦难得到推广。因此，如何使重建的外耳道更接近生理状态并保证其稳定(如保持填塞骨粉及肌肉的体积、促进新生骨质形成)、降低不良反应的发生率(提高上皮化及血运建立的速度、降低感染机会)一直是耳科学的难点，也一直是耳科医师关注的问题。近年来，鉴于L-PRF及PRP在骨科、口腔科等用于软组织及骨组织的修复和重建的经验，有耳科医师尝试将L-PRF及PRP用于耳科的组织修复重建中。

Ensari通过动物试验证实L-PRF可促进鼓膜穿孔的愈合[L-PRF组平均(10.3±2.2)d,对照组为(17.0±2.4)d]，且L-PRF可促进鼓膜的纤维化和新血管形成[25]。对比用膜状L-PRF及纸片处理急性鼓膜空孔的效果，认为L-PRF组穿孔愈合更早、愈合率更高、术后听力更好[26]。在21例开放式乳突根治术中用PRP及自体骨片重建外耳道后壁，术后外耳道形态良好且上皮化良好[27]。本文作者所在课题组亦在总结其他科室应用的基础上，用L-PRF联合自体骨粉重建开放式乳突根治术后的外耳道后壁，术后定期随访，结果显示重建后的外耳道后壁较其他重建方式(如骨片、肌肉)形态更接近生理状态，可达到自洁的目的，此部分工作仍在进行中。以上均提示PRP或L-PRF在耳科手术中的应用前景广阔，但基于相关报道较少且样本量有限，仍有待设计更加合理的动物及临床试验验证，这也是本人日后工作的方向。

5 结论

L-PRF来自于自体静脉血，具有安全、取材方便、容易制备、造价低廉和结构稳定、可较长时间发作生物学效应的优点，其富含有多种生长因子，能够促进组织的再生及修复，尤其在促进上皮化、新生血管生长及成骨方面作用显著，L-PRF网状结构内部的白细胞使其同时具备抗感染的能力。L-PRF在多个学科的临床工作中应用广泛，收效良好。其优良的生物学特性在耳科学中亦具有广阔的应用前景，有待进一步探讨发掘。