子痫前期孕妇外周血游离DNA的研究进展

周嘉怡，吴逊伟，戴莉娟，赵瑰丽，余波澜

(广州医科大学附属第三医院 广东省产科重大疾病重点实验室 广东省母胎医学工程技术研究中心，广东 广州 510150)

1969年，孕妇血浆中发现了胎儿细胞[1]；1997年，通过PCR扩增携带男性胎儿的孕妇血浆和血清中Y染色体特异性序列，证实了母体血液中存在着胎儿游离的DNA(cell free fetal nucleic acid，cff-DNA)[2]。自此无创产前检测技术(non-invasive prenatal test，NIPT)伴随着胎儿特意标志物不断的发展，在许多研究下，无论体外或者体内证据都证明，cff-DNA来源于胎盘，并且可以通过cff-DNA检测胎盘的健康与相关的妊娠疾病，例如妊娠期高血压疾病、子痫前期、早产、胎儿宫内生长受限等。而妊娠期高血压疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是孕产妇发病率和病死率的主要原因，并且使6%～8%的妊娠期复杂化[3]。据报道， 全世界16%的孕产妇死亡是由高血压引起

的;妊娠期高血压疾病的危险因素有年龄、多次妊娠、慢性高血压(chronic hypertension，cHTN)、其他外周血管以及妊娠期高血压病史等，但具体的发病机制仍不能确定[4]。根据国际妊娠高血压研究学会(international society for the study of hypertension in pregnancy，ISSHP)妊娠期高血压(gestational hypertension，GH)定义为妊娠20周后新发高血压[血压140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上]，尿中无蛋白。子痫前期(preelcampsia，PE)定义为新发高血压，其特征是妊娠20周后24 h尿样尿液中蛋白含量为300 mg以上，血压为140/90 mmHg以上。PE基于严重程度可分为两类，第一是轻度到中度(mild preeclampsia，MPE)定义的血压140/90 mmHg和159/109 mmHg， 24 h尿样尿液中蛋白含量大于300 mg但不超过2.0 g。第二类为重度子痫前期(sever preeclampsia，SPE)，定义为收缩压大于160 mmHg或舒张压大于110 mmHg，24 h尿样尿液中蛋白含量大于2.0 g[5]。

1 胎儿游离DNA在PE中的变化

PE的发病机制较为清楚，确切病因仍难以捉摸的。其中普遍认为PE的发病机制包括子宫胎盘灌注下降，导致缺氧胎盘[6]，同时循环促炎因子和血管生成因子的改变，以及系统性内皮功能障碍[7]。婴儿分娩和胎盘排出后导致子痫前期的症状消失[8]，这现象表明了在PE的发病机制中胎盘的作用。目前的理论主要支持孕妇血浆中cff-DNA的来源是胎盘滋养细胞的凋亡与坏死所释放出来的胎儿DNA。并且在PE患者血液中观察到cff-DNA和总循环游离DNA(circulating free DNA，cf DNA)的增加可能与胎盘螺旋动脉异常重构、氧化应激增加和缺血有关，导致胎盘源性颗粒或因子的释放[9]。缺血性胎盘的概念导致细胞碎片的释放，这一概念被进一步细化，包括微泡和纳米泡、胎儿DNA以及最近的外泌体等颗粒，这些从胎盘释放的细胞碎片充当着危险相关分子模式(danger associated molecular patterns,DAMP)，最近的实验研究证明，在小鼠体内，细胞外囊泡可引起小鼠胎盘无菌炎性反应和PE的类似症状[10]。并且Toll样受体9(TLR9)最初被称为外源DNA片段的传感器，在小鼠妊娠模型中，胎儿提取的DNA和TLR9激动剂会使怀孕小鼠诱发炎性反应，主要是通过增加炎性细胞因子IL-6、sENG和sFlt1分泌，引起妊娠小鼠出现PE样特征，如高血压、蛋白尿、胎盘炎症和胎儿生长受限[11]。因cff-DNA的去甲基化的程度比母体的DNA高，特别是低甲基化的CpG DNA序列，这有可能是TLR9的强配体[12]。有趣的是，妊娠期间发生子痫前期，其绒毛滋养细胞凋亡的异常增加和含有cff-DNA的细胞碎片的释放有关，刺激母体炎性反应发生，促使母体内皮功能障碍，而其中的原因可能要归因于妊娠疾病中嗜中性粒细胞的激活[13]。活化的嗜中性粒细胞挤出染色质纤维网，称为嗜中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)，以消除病原体。 NET的主要结构是DNA和组蛋白。这些碎片激活中性粒细胞并释放DNA，从而形成PE中所见的cf DNA总量，并且在患有PE的妊娠妇女中已观察到NETs的过量产生[13]。

另外在不同程度的PE，其总cf DNA和cff-DNA通过定量可反应其严重程度。在重症子痫前期和轻或中度子痫前期中的总cf DNA和cff-DNA都增加[14]。但与MPE相比，SPE患者cff-DNA和总cf DNA均升高，而且SPE组循环cf DNA增加可能是由于这些疾病中胎盘病理的差异，同时SPE患者中的胎盘以合胞结和梗死数量增加为特征，这可能与胎盘灌注减少有关[15]。

2 胎儿分数与PE的关系

cff-DNA是由凋亡和坏死的胎盘合胞滋养细胞释放而来，而胎儿分数是cff-DNA的数量除以总cf DNA，在大多数妇女怀孕10周时超过4%。研究发现胎儿分数与妊娠34、37周前PE风险存在显著负相关，即胎儿分数越低，妊娠发生PE的风险越高[16]。这与先前报道的比较了发展成PE的女性和没有发展PE的女性的胎儿分数结果一致。其结果的差异可能是由于cff-DNA相对于母体cf DNA的增加不那么明显，从而导致胎儿分数的减少。同时PE的早期妊娠标志物与胎儿分数有密切的关系，如平均动脉压、妊娠相关血浆蛋白A、胎盘生长因子，子宫动脉搏动指数，胎儿分数与平均动脉压和子宫动脉博动指数呈负相关，与妊娠相关血浆蛋白A和胎盘生长因子呈正相关。胎儿分数越低，发生PE的风险越高[16]。因此cf DNA检测中胎儿分数低可能是胎盘发育不良和胎盘功能障碍的一个标志。

3 DNA甲基化在PE中的表达差异

因为cff-DNA相对于背景较大的母体DNA浓度较低，缺乏普遍的胎特异性DNA标志物，限制了其在NIPT广泛的临床应用。表观遗传改变是细胞内基因组以外的其他可遗传物质发生的改变，使基因型未发生变化而表型却发生了改变。这种改变在有丝分裂时保持稳定，通过减数分裂代代相传。组织特异性DNA甲基化模式的差异可用于区分母体DNA和胎盘DNA。在2002年发现母胎DNA之间存在表观遗传学差异[17]，随后发现位于ERG、RUNX3、LINE-1、和HSD11B2基因等大量基因在母胎DNA上存在甲基化差异[1 8-19]，其后ERG被证实在母体DNA为低甲基化，在胎儿DNA为高甲基化[19]，正常孕妇血浆中甲基化ERG基因的检出量随妊娠进展而呈升高趋势，提示ERG基因含量在母体血浆中随孕周增加而增加[19]。而对于RUNX3、LINE-1、和HSD11B2基因，研究发现HSD11B2基因编码在高血压中起关键作用的11β羟基类固醇脱氢酶2型。其主要通过阻止睾丸和胎盘等组织中盐皮质激素受体的激活，在血压调节中起重要作用。与对照组相比，患有PE的母体中RUNX3、LINE-1和HSD11B2基因的甲基化下降，但这种降低并不明显。 有趣的是，在PE患者中，HSD11B2、RUNX3和LINE-1甲基化与儿童的出生体质量，胎龄和分娩呈正相关[18]。

SERPINB5基因定位于染色体18q21.33主要表达子宫胎盘组织[20]。过往的研究报道SERPINB5基因在胎盘中呈现低甲基化状态，并在母体血液中呈现高甲基化[21]。乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(mammary serine protease inhibitor，MASPIN)是由SERPINB5基因编码的人类蛋白质，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族[22]。SERPINB5的启动子的甲基化状态是影响妊娠早期绒毛外滋养层细胞迁移和侵袭的重要因素。 甲基化状态的降低可以抑制绒毛外滋养层细胞(extravillous trophoblasts，EVTs)的迁移和侵袭，从而影响胎盘形成，并可能导致胎盘缺血和缺氧[22]。同时之前的研究已发现子痫前期孕妇血浆未甲基化的SERPINB5基因含量比正常妊娠孕妇增加约5.5倍[23]。因此，母体血浆中未甲基化SERPINB5可作为胎儿特异性标志物，可用于测定cf DNA。SPE孕妇母体血液中的未甲基化SERPINB5水平高于正常妊娠的孕妇，但因未甲基化SERPINB5在MPE与妊娠晚期正常孕妇的表达无明显差异性，因此未甲基化SERPINB5可能不是MPE的良好标志物[23]。

近期发现在子痫前期的血浆中，STAT5A启动子甲基化较正常妊娠晚期的血浆要低，提示STAT5A抗凋亡的作用下降，胎盘的滋养层细胞的凋亡率会增加，cf DNA会增加[24]。STAT5A启动子区域，位于母体和胎盘DNA之间。STAT5A在各组胎盘组织中均表现出较高的甲基化水平，提示它是一种更有效的表观遗传标记。并且也观察到在PE患者中最明显失调的是母体表达的转录因子DLX5，约70%的PE样品中DLX5上调显著，其胎盘表达与PE的血清生物标志物水平相关，包括胎盘生长因子比上可溶性Fms样酪氨酸激酶。在滋养细胞细胞系中，DLX5的过表达导致增殖减少，增加新陈代谢和激活内质网应激反应[25]。这表明了表观遗传变化在PE疾病的发展和进程中起着至关重要的作用。不同途径中的每个表观遗传变化都会导致PE的发生，与PE相关的变化之一是DNA甲基化变化。因此使DNA甲基化用于PE的无创产前诊断成为可能，而且DNA甲基化不受性别和基因多态性影响。纵观表观遗传学研究，由于基因的表观遗传受较多因素的影响，如环境、遗传和营养等，使得其实验的重复性较差，稳定性也相对较弱。目前而言并不能完全作为一种诊断疾病的生物标志物。虽然如此，但通过了解PE中主要的表观遗传学变化，有助于在治疗研究方面上提出一个猜想——是否纠正这些表观遗传学的变化可预防或治疗对应的疾病，同时也为产前诊断提供了一个全新的思路。

4 问题与展望

过去20年来，母体血浆游离胎儿核酸分析取得了快速进展。该领域始于1997年使用PCR进行单基因检测，并已发展成研究者可以分析整个胎儿全基因组，并且不断研究循环cff-DNA在胎儿全基因组的作用，这将有助于将来确定胎儿每个基因的完整DNA序列。这些发展的方面已经影响了临床实践，对于子痫前期的研究在不断的深入并且可能在不久的未来会出现相关的非侵入性产前诊断方法。随着技术的进一步发展和成本的降低，胎儿甲基组学和转录组学分析有可能最终成为常规临床试验。因此，外周游离核酸基因组分析可能在未来的产前医学实践中发挥越来越重要的作用。