光激化学发光法在D-二聚体单克隆抗体筛选中的应用

侯寒进，蒋佳利，冯文卓，贾俊臻，刘 彦，马 巍，董 媛

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

血栓性疾病作为危害人类健康的重大疾病，高漏诊率和致死率一直居高不下，因此对血栓疾病诊断的精确度也在不断提高。D-二聚体是一种可靠的血栓疾病诊断病理性凝血标志物，正常人D-二聚体的水平低于0.5 mg/L[1]。在某些疾病导致的异常凝血状态下，如肺栓塞、深静脉血栓、弥散性血管内凝血等，D-二聚体浓度显著增高[2]。因此D-二聚体的精确检测对血栓类疾病的临床诊断意义重大。

1 D-二聚体检测方法

1.1 乳胶凝集法

乳胶凝集法自诞生以来，凭借其操作简单和无需外界器材等优势，在抗体筛查、病毒检测和细菌筛选等方面被广泛应用[3-5]。正常情况下聚苯乙烯乳胶颗粒结合后牢固性差，易与特异性抗体剥离脱落，对实验结果的准确性造成影响。在乳胶凝集法中，调节pH后使胶体颗粒携带电荷增多，电荷黏附能力增加，实验精确度也随之提高。

半定量的D-二聚体检测方法通常采用乳胶凝集法，D-二聚体在调节pH值后与包被抗体的乳胶粒子结合，发生凝集反应[6]。检测时间约2 min，因其简便快捷的特性，该方法在临床检测广泛使用。乳胶凝集法对D-二聚体检测建立在特异性抗体上，检测前需对乳胶颗粒包被抗体。由于D-二聚体与纤维蛋白原降解产物二者同为纤维蛋白在纤维蛋白酶水解后的产物，具有相同抗原表位，因而抗体特异性很大程度上决定了检测结果的准确性。

1.2 酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)应用于D-二聚体检测的原理与传统ELISA试剂盒相似。首先将D-二聚体抗体包被到固相载体，随后加入含有D-二聚体抗原的血浆，二者发生反应结合在一起后，加入酶标抗体，随后加入底物显色并终止后，即可观察结果[7]。颜色深浅与浓度成正相关，即可用酶标仪测其OD值做标准曲线计算具体浓度。相较于乳胶凝集法，快速ELISA法敏感性更高，稳定性更强，更适用于单样本的检测[8]。

2 目前现有的D-二聚体抗体

自单克隆抗体制备问世以来，抗体发展突飞猛进。以D-二聚体为例，目前市售的D-二聚体抗体均来源于鼠源单克隆抗体。此外，田超伟及其团队构建了噬菌体基因文库，并成功获得了D-二聚体抗体，为靶向栓溶剂的发展奠定了基础[9]。

3 单克隆抗体筛选方法

目前常用的特异性抗体筛选方法是间接ELISA法。O’donnell等的研究表明，在测定蛋白酶3时，不同于直接ELISA法，间接ELISA有更高的灵敏度，但需要将灵敏度的临界值调高才能避免一些非特异性结合[10]。然而，即使间接ELISA具有高灵敏度，但其在临床应用中仍有漏筛的可能[11]。同时在反应过程中，高概率会发生交互反应[12]。在实际操作中，除了必须加样操作外，洗板占据了大部分时间，耗时费力的问题仍待解决。

4 光激化学发光法

4.1 光激化学发光技术的应用

光激化学发光(light initiated chemiluminescent assay，LiCA)，是建立在均相免疫检测技术基础上的化学发光反应。其免疫反应体系中，待测抗体包被在感光微球，羊抗鼠二抗包被在发光微球上。感光微球和发光微球内分别含有和二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物，二者通过转化高能态离子氧，在200 nm范围内完成发光。凭借其高通量特性，在各领域均有广泛应用[13]。如贺安等在LiCA技术基础上研发的NSE-Alpha LISA试剂盒，对神经元特异性烯醇化酶的检测可达临床要求[14]。边颖及其团队建立了蛋清IgE光激化学发光诊断方法，为临床诊断提供了依据[15]。

4.2 光激化学发光在抗体筛选中的应用

徐娟等的研究表明，在相同条件下，与传统的ELISA方法相比，光激化学发光法需要的试剂即抗体量更少，以信噪比为指标，LiCA具有更好的信噪比[16]。在低浓度样品的检测中，ELISA方法因灵敏度低易发生漏，LiCA中由激发光产生离子氧，传递至发光微球后最终产生发射光，信号逐级放大，灵敏度更高。与传统抗体筛选方法相比，LiCA凭借其高通量筛选，短时间内即可完成大量样本的检测，同时机器加样省去清洗步骤，极大地缩短了反应时间[17]。

目前中国血栓性疾病患者人数达2.9亿，伴随着人口老龄化，这个数字会逐年增长[18]。血栓疾病检测市场前景巨大，现有的检测手段依赖于抗原抗体免疫反应，特异性抗体在检测中成为不可缺少的一环。而抗体的筛选过程中，传统方法的效率低下延长了筛选的进程[19]。光激化学发光为该问题提供了新的解决思路。因高通量的特性，LiCA在将来应用的领域会不断发展，应用更加广泛。