五味子多糖对NAFLD大鼠肝脏SREBP2/HMGCR表达的影响

吴金滢，王春梅

(1.吉林医药学院，吉林 吉林 132013；2.北华大学，吉林 吉林 132013)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是临床上常见的一种代谢应激性肝脏损伤，主要是由遗传易感、过度肥胖、Ⅱ型糖尿病、高脂血症等相关因素而造成，严重者可导致肝脏纤维化、肝癌等，危害人类的健康[1]。近年来，由于生活条件及饮食结构的改变，使得该病患病率不断升高，已经影响全球人口的1/3[2]。NAFLD发病机制复杂，目前除了控制饮食、适当运动，还没有有效的治疗手段。有研究表明脂质代谢紊乱是导致NAFLD发生发展的重要因素，而固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs)是肝脏脂代谢的关键调控因子，其表达上调，可导致甘油三酯和胆固醇代谢紊乱，促进NAFLD的发展，被认为是防治NAFLD的关键靶点[3]。

五味子是吉林省道地药材，被古代医家奉为上品，具有多种药理功效[4]。研究表明，北五味子粗多糖(Schisandrachinensispolysaccharide,SCP)对酒精和四氯化碳所致小鼠急性化学性肝损伤具有明显的保护作用[5-6]，对高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠肝脏也起到保护作用，且具有显著的调节血脂作用[7-8],因此推测SCP对NAFLD具有防治作用。本研究在前期工作基础上，建立高脂饮食诱导的大鼠NAFLD模型，以肝脏胆固醇代谢紊乱为切入点，探讨SCP防治NAFLD的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验动物及饲料:雄性SPF级SD大鼠,长春市亿斯实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(吉)2018—0007，体重160～180 g。实验大鼠分笼饲养，饲养室(清洁级)温度18～23 ℃，湿度40%～60%，明暗交替，每日喂食，自主饮水。实验大鼠的普通饲料及高脂饲料均由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。其中高脂饲料含有猪油(15%)、蔗糖(20%)、胆固醇(1.2%)、胆酸钠(0.2%)、酪蛋白(10%)、磷酸氢钙(0.6%)、基础饲料(53%)。

实验仪器设备:ESJ110-4B电子分析天平(沈阳龙腾电子有限公司)，Centrifuge 5424R离心机(德国艾本德仪器制造有限公司)，AX-ⅡX射线摄影暗匣(广东奥华医疗器械厂有限公司)，全自动酶标仪(瑞士TECAN公司)，电泳仪(美国Bio-Rad)，RT-PCR系统(德国Biometra ABI 7500)。

实验药品和试剂:SCP(吉林医药学院药物分析实验室制，用蒸馏水配制成所需要的浓度后，使用超声波细胞粉碎机进行乳化，功率为400 W，间隙3 s/次，时间为15 min，混匀后于4 ℃冰箱保存待用)，SREBP-2抗体和HMGCR抗体(武汉Abclonal)，引物(北京鼎国)，BCA蛋白测定试剂盒、RIPA裂解液(强)、PMSF、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(碧云天生物技术研究所)。

1.2 NAFLD大鼠模型的建立、分组及给药

将40只大鼠随机分成4组，每组10只，分别为正常对照组(CON)、正常+SCP给药组(CON+SCP 100 mg/kg)、NAFLD模型组(NAFLD)、NAFLD模型+SCP治疗组(NAFLD+SCP 100 mg/kg)。CON、CON+SCP组以普通饲料喂养，NAFLD、NAFLD+SCP组以高脂饮食喂养。4周后，禁食12 h，眼球取血，检测大鼠血清中总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)的含量，确定大鼠出现高脂血症。造模成功的高脂血症大鼠采用灌胃方式进行给药，CON组及NAFLD组给予等体积溶媒；正常+SCP组及模型+SCP组给予SCP 100 mg/kg。全部大鼠均每日灌胃一次，灌胃8周，并每周测量每只大鼠体重。

1.3 血清生化指标检测

治疗结束后，所有大鼠禁食12 h，乙醚麻醉，腹主动脉取血，3500 r/min离心10 min，收集上层血清，按照试剂盒说明书检测TC、TG、LDL-C和HDL-C。

1.4 RT-PCR检测

用Trizol试剂(Invitrogen，美国)从大鼠肝组织中提取总RNA，并按照HiScriptRⅡ一步qRT-PCR试剂盒(鼎国，北京)的操作方法进行逆转录进行，最终体积为20 μL。PCR引物序列使用primer 6.0软件设计，并由鼎国长生生物科技有限公司(北京)合成。基因表达水平使用SYBR qPCR试剂盒(鼎国，北京)在RT-PCR系统(ABI 7500，Biometra，德国)上进行分析。根据Ct值，计算2-ΔΔCt，并进行统计分析。

1.5 Western blot检测

BCA法测定大鼠肝组织总蛋白浓度，电泳分离目标蛋白，转膜，随后用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭1 h。加入Ⅰ抗(SREBP-2和HMGCR，1∶2000稀释)4 ℃过夜。TBST缓冲液洗涤3次后室温孵育Ⅱ抗1 h，ECL显影，拍照并分析结果。

2 结 果

2.1 SCP对NAFLD大鼠血脂的影响

结果如表1所示，模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平显著高于正常对照组，HDL-C的水平显著降低(P<0.01)，说明高脂饮食诱导的高脂血症模型成功。而与模型组比较，SCP多糖治疗8周显著降低了NAFLD大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，提高了HDL-C水平，提示SCP对NAFLD大鼠的脂代谢紊乱具有一定的调节作用。

表 1 SCP对NAFLD大鼠血脂的影响(±s,n=10，mmol/L)

表 1 SCP对NAFLD大鼠血脂的影响(±s,n=10，mmol/L)

组别TCTGLDL-CHDL-CCON3.26±0.210.92±0.150.98±0.061.79±0.31CON+SCP3.07±0.250.89±0.140.95±0.121.75±0.32NAFLD5.98±0.65**1.58±0.29**2.34±0.32**1.14±0.17**NAFLD+SCP4.48±0.77#1.21±0.18#1.28±0.25#1.48±0.29#

与CON组和CON+SCP组比较**P<0.01；与NAFLD模型组比较#P<0.05

2.2 SCP对NAFLD大鼠肝脏SREBP-2/HMGCR基因表达的影响

与正常组对照相比，NAFLD模型组大鼠肝脏胆固醇代谢调节关键蛋白SREBP-2和HMGCR mRNA表达水平均明显升高(P<0.01)。与NAFLD模型组比较，SCP治疗显著下调了SREBP-2和HMGCR的MRNA表达(P<0.05)。结果见图1。

与正常组比较**P<0.01；与NAFLD模型组比较#P<0.05

2.3 SCP对NAFLD大鼠肝脏SREBP-2/HMGCR蛋白表达的影响

与正常对照组比较，NAFLD模型组大鼠肝脏胆固醇代谢调节关键蛋白SREBP-2和HMGCR蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。与NAFLD模型组比较，SCP治疗后显著降低了SREBP-2和HMGCR蛋白的表达水平(P<0.05)。结果见图2。

与正常组比较**P<0.01；与NAFLD模型组比较#P<0.05

3 讨 论

NAFDL是以肝脏细胞脂肪变性和脂肪沉积为病理特征的慢性肝病，其发病率在国内外呈明显上升趋势。目前临床尚缺乏有效的治疗药物。近年来，中医药在调节机体脂代谢紊乱方面的应用越来越受到重视。五味子是传统医学中著名的保肝降酶药物，对化学性肝损伤、病毒性肝损伤等均具有良好的效果。本研究进一步证实SCP可降低高脂饮食诱导的NAFLD大鼠的血脂水平，改善其脂代谢紊乱，缓解脂肪性肝病的进程。

众多研究表明，脂质代谢紊乱能够导致肝脏细胞内脂质严重蓄积，从而形成NAFLD。SREBPs是一类位于内质网上的膜连接蛋白，具有核转录因子活性，参与调控胆固醇、甘油三酯和脂肪酸的生物合成关键转录调控因子。其中SREBP-2是SREBPs典型的一种表达形式，主要参与介导胆固醇生物合成的反馈调节。HMGCR属于SREBP-2下游重要调控因子，是胆固醇合成的限速酶[9]。SREBP-2的异常表达可引起游离胆固醇、脂肪酸代谢紊乱，成为了导致NAFLD发病的重要因素。本研究发现，实验大鼠经高脂饮食喂养后，NAFLD模型大鼠肝脏组织中SREBP-2和HMGCR基因和蛋白表达水平均明显升高，而通过SCP治疗后的大鼠肝脏组织中SREBP-2和HMGCR基因和蛋白表达水平均明显降低，从而减少胆固醇的内源性合成，达到对细胞内胆固醇水平的有效调控。

综上所述,本研究证实了SCP能够调节NAFLD大鼠的血脂紊乱,其作用机制可能与下调肝脏胆固醇代谢关键因子SREBP-2/HMGCR表达有关。