冠心病外周血IL-7表达变化对机体免疫应答的影响及可能机制

朱继田 李倩 谢后田 祖雪芹 黄伟 黄涛

(宿州市立医院心血管内科，安徽 宿州 234000)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)发生、发展与冠脉血管壁组织中的炎症反应明显相关〔1〕；炎症反应可促进免疫细胞和血小板在血管内皮细胞表面的黏附和激活，导致内部出血或斑块破裂，继发性血栓形成，引发不稳定型心绞痛、急性心肌梗死的发生〔2〕。黏蛋白结构域的分子(Tim)3是动脉硬化的负调控因子，可提升调节性T细胞活性，下调效应性T细胞活性，抑制动脉粥样硬化斑块的形成〔3〕。但关于Tim3在冠心病中的调控机制目前仍未完全明确。研究者发现，白细胞介素(IL)-7可调控T细胞表面Tim3表达，参与慢性病毒感染的发生与发展〔4〕。本研究在体外培养冠心病患者外周血单核细胞，观察IL-7对患者T细胞表面Tim3的调控作用，探讨IL-7和Tim3在冠心病发生、发展中的作用。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2016年6月至2018年12月宿州市立医院收治的冠心病患者164例。均符合2015年中华医学会心血管分会制定的冠心病诊治指南中的诊断标准；排除合并肝肾功能不全、糖尿病、脑血管疾病的患者。其中男94例，女70例；年龄56～82岁。根据患者入院时临床症状、心电图、心脏彩超、冠脉造影结果，根据病情分为：稳定型心绞痛组44例、不稳定型心绞痛组78例、急性心肌梗死组42例。选取同期在医院体检的性别、年龄相匹配的健康人群40例为正常对照组，其中男24例，女16例；年龄55～80岁。冠心病患者与正常对照组受试者性别、年龄之间差异无统计学意义(P>0.05)，本研究经医院伦理委员会审核批准，受试者均签署知情同意书。

1.2主要试剂 淋巴细胞分离液购于上海慧颖生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培养基购于北京雅安达生物技术有限公司；IL-7酶联免疫吸附试验检测试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司；兔抗人转录激活因子(STAT)-5、磷酸化(p)-STAT-5单克隆抗体，鼠抗人细胞因子信号通路抑制因子(SOCS)3、β-actin单克隆抗体，鼠抗人β-actin单克隆抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人免疫球蛋白(Ig)G、鼠抗人IgG购于美国PeproTech公司。

1.3方法

1.3.1外周血单核细胞分离及培养 采集各组受试者外周血10 ml，肝素抗凝处理后使用葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度离心法分离外周血单核细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃ 10%CO2浓度培养箱中培养并传代，细胞计数后按1×106/孔的密度接种于24孔板中，设置3个复孔，加入终浓度为30 ng/ml的重组IL-7刺激12 h，并设置无重组IL-7刺激的对照孔正常培养12 h，收集细胞用于检测。

1.3.2流式细胞术检测 取各组外周血单核细胞转入流式细胞检测管中，磷酸缓冲液洗涤后加入CD3(PERCP)、CD14〔复合荧光素(APC)-Cy7〕、CD8〔异硫氰酸荧光素(FITC)〕、荧光标记(TIM)-4-PE得州红(Texasred)，避光条件下4℃静置40 min，磷酸缓冲液洗涤后使用2%多聚甲醛固定后上流式细胞仪检测Tim3阳性细胞占CD4+、CD8+T细胞的比例。

1.3.3血清IL-7浓度检测 采集各组受试者清晨空腹外周静脉血3 ml，2 000 r/min离心10 min，收集上层血清，-20℃保存待测。酶联免疫吸附试验检测血清IL-7浓度，试剂盒购于江苏宝莱生物科技有限公司，操作严格按试剂盒说明进行。

1.3.4Western印迹检测 取未刺激和重组IL-7刺激12 h后的急性心肌梗死患者外周血单核细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，离心收集上清，双辛酸钠(BCA)定量，行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，滴加兔抗人STAT-5、p-STAT-5单克隆抗体(1∶500)，鼠抗人SOCS3单克隆抗体(1∶300)，鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶1 000)，4℃过夜，滴加HRP标记的兔抗人IgG，鼠抗人IgG，均为1∶1 000稀释，室温下静置2 h，电化学发光(ECL)显色，避光显影，采集图像，使用Image J软件分析电泳条带灰度值。

1.3.5重组IL-7刺激对外周血单核细胞表面Tim3表达的影响 选取28例急性心肌梗死组患者和18名正常对照组受试者的外周血单核细胞，向细胞培养基中加入重组IL-7刺激12 h后收集外周血单核细胞进行流式细胞术检测。

1.4统计学分析 使用SPSS21.0软件进行t检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1外周血CD4+、CD8+T细胞Tim3表达水平分析 稳定型心绞痛组、不稳定型心绞痛组、急性心肌梗死组外周血Tim3阳性细胞占CD4+T细胞的比例明显高于正常对照组，急性心肌梗死组外周血Tim3阳性细胞占CD4+T细胞的比例明显高于稳定型心绞痛组、不稳定型心绞痛组(P<0.05)。不稳定型心绞痛组、急性心肌梗死组外周血Tim3阳性细胞占CD8+T细胞的比例明显高于正常对照组，急性心肌梗死组外周血Tim3阳性细胞占CD8+T细胞的比例明显高于稳定型心绞痛组、不稳定型心绞痛组(P<0.05)。见表1。

表1 各组外周血Tim3阳性细胞占CD4+、CD8+T细胞的比例

与正常对照组相比:1)P<0.05；与稳定型心绞痛组相比:2)P<0.05；与不稳定型心绞痛组相比:3)P<0.05

2.2血清IL-7浓度及与CD4+、CD8+T细胞Tim3表达的相关性分析 正常对照组、稳定型心绞痛组、不稳定型心绞痛组、急性心肌梗死组血清IL-7水平分别为：(36.28±12.61)pg/ml、(39.45±19.30)pg/ml、(40.87±16.75)pg/ml、(67.71±17.48)pg/ml。急性心肌梗死组血清IL-7水平明显高于正常对照组(P<0.01)；稳定型心绞痛组和不稳定型心绞痛组血清IL-7水平与正常对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关性分析显示，血清IL-7浓度与Tim3+CD4+T、CD8+T细胞比例均无相关性(r=0.561、0.428，均P>0.05)。

2.3重组IL-7刺激对外周血单核细胞表面Tim3表达的影响 正常对照组重组IL-7刺激12 h的CD4+T细胞表面Tim3表达水平较未刺激者升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；急性心肌梗死组重组IL-7刺激12 h的CD4+T细胞表面Tim3表达水平较未刺激者明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、急性心肌梗死组重组IL-7刺激12 h的CD8+T细胞表面Tim3表达水平较未刺激者明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4重组IL-7刺激后外周血单核细胞中IL-7信号通路相关分子表达水平分析 重组IL-7刺激后p-STAT-5蛋白相对表达量为3.69±0.57，明显高于未刺激的细胞中0.52±0.08，差异有统计学意义(P<0.01)；重组IL-7刺激与未刺激STAT-5蛋白相对表达量分别为5.53±0.81、5.84±0.97，差异无统计学意义(P>0.05)；重组IL-7刺激后SOCS3蛋白相对表达量为3.03±0.45，明显高于未刺激的细胞中1.91±0.24，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

表2 两组IL-7刺激与未刺激的外周血Tim3阳性细胞占CD4+、CD8+T细胞的比例

与未刺激相比：1)P<0.05

1未刺激；2 重组IL-7刺激12 h后图1 IL-7信号通路相关分子表达的Western印迹电泳

3 讨 论

Tim3为T细胞免疫球蛋白黏蛋白家族成员，其与程序性死亡受体(PD)-1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA)4等共同参与肿瘤和病毒感染的发生、发展，引发T细胞衰竭和免疫耐受〔5〕。抑制Tim3表达是目前恶性实体瘤的主要免疫疗法之一〔6,7〕。研究者发现，在抗肿瘤免疫反应和适应性耐药性引发的免疫异常中Tim3表达上调仅出现于CD4+、CD8+T细胞中，抗PD-1药物与抗Tim3抗体联用可有效抑制抗PD-1耐药性的产生，提升T细胞的抗癌活性〔8〕。Tim3的免疫抑制活性在部分感染性疾病中能够发挥免疫保护作用〔9〕。丙型病毒性肝炎中Tim3介导的信号通路可通过抑制辅助型T细胞(Th)17细胞分泌IL-16，增强调节性T细胞活性，避免肝细胞因免疫炎症反应过强而引发的损伤〔10〕。目前研究认为，冠心病属于炎性疾病的一种，在动脉粥样硬化发生、发展中Tim3可通过抑制CD4+、CD8+T细胞功能，减少促炎症因子的分泌，增强斑块稳定性，缓解病情〔11,12〕。本研究显示，冠心病患者中不稳定型心绞痛和急性心肌梗死患者Tim3阳性细胞占CD4+、CD8+T细胞比例明显升高，其中以急性心肌梗死患者升高最明显，提示Tim3高表达可能对T细胞发挥抑制作用，进而影响机体的免疫炎症应答，抑制心肌细胞损伤加重，防止病情进展。

IL-7与IL-4、IL-9同属于共同γ链细胞因子，参与调控T细胞生长、分化过程〔13〕。虽然研究者发现冠状动脉粥样硬化患者中IL-7表达无明显变化，但IL-7在不稳定型心绞痛患者中可与血小板、趋化因子等相互作用，促进冠心病恶化〔14，15〕。本研究显示，IL-7在稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛患者血清中浓度均未出现明显升高，但在急性心肌梗死患者血清中的浓度明显高于同年龄段健康人群。为进一步探究IL-7在急性心肌梗死患者血清中升高的意义，本研究通过重组IL-7刺激急性心肌梗死患者和同年龄段健康人群中分离的外周血单核细胞，结果显示重组IL-7能够上调急性心肌梗死患者CD4+、CD8+T细胞表面的Tim3表达。提示重组IL-7诱导的Tim3表达上调在可进一步促进冠心病患者中Tim3的免疫抑制功能，缓解机体受到的免疫损伤。

研究者发现，慢性病毒感染过程中，IL-7信号通路促进STAT-5磷酸化，诱导细胞因子分泌，促进细胞增殖，下调抑制因子的表达水平，对抗免疫耐受。本研究对IL-7诱导急性心肌梗死患者外周血单核细胞中Tim3表达升高的机制分析显示，重组IL-7刺激后，可促进STAT-5磷酸化，上调抑制因子SOCS3表达，提示IL-7在冠心病患者中的作用可能与慢性病毒感染中的作用完全相反，具体机制仍需进一步深入研究。同时，稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛患者血清IL-7浓度无明显提升，但Tim3表达水平明显升高，提示可能存在其他分子机制诱发Tim3表达上调，仍需进一步深入研究。