一株耐As 细杆菌对As3+的吸附特征与机理

2020-02-12汤思敏林晓敏焦文清梁颖宜

中南林业科技大学学报 2020年2期

汤思敏，朱健，林晓敏，周韬，周灯，黄超，王平，焦文清，梁颖宜

（1.中南林业科技大学环境科学与工程学院，湖南长沙 410004；2.稻米品质安全控制湖南省工程实验室，湖南长沙 410004）

砷（As）分布广泛且具有致癌性，被认为是世界上最危险的化学物质之一[1]。水体As 污染主要来源于自然源与人为源，如长期的地球化学变化与矿物矿石释放；冶金、陶瓷、染料和农业制药厂等的工业废水排放[2-4]。在天然水中发现的两种主要As 形态为As（V）砷酸盐与As（III）亚砷酸盐，它们的存在取决于pH 和氧化还原条件[5]。由于现今As 污染日益严重并对人类健康和生态系统造成不利影响，As 污染已成为世界上最为关注的环境污染问题之一[6-8]。

由于As 污染的治理比较困难，迄今为止，有许多传统技术被用于去除水中的砷，包括浮选，凝聚-沉淀，吸附，离子交换，膜过滤和电化学处理氧化还原、化学沉淀、过滤等，但因成本高、选择性低、能耗高等缺点限制了它们的进一步应用[9-11]。生物吸附被普遍认为是一种行之有效的水体As 污染去除方法[12]。自20 世纪90年代，生物质被用于去除水体重金属。生物吸附不仅受生物量的类型或化学组成的影响，而且受外界物理化学因素和溶液化学的影响[13]。近年来，微生物作为生物吸附剂的应用比其他种类的生物吸附剂受到了更多的关注。已有研究报道了活菌和死菌与水体环境As 的去除作用，但无生命的生物质往往是首选的，因为此种生物吸附剂可以在极端pH 值下重复使用，用于连续处理有毒污染物，此外，由于不需要使用生长介质，死菌生物质具有较好的成本效益和安全性[14]。

纵观微生物修复水体重金属污染的研究，国内外关于细杆菌属Microbacterium去除水体中重金属的研究主要集中于Cr、Cu 等元素，而关于该菌属去除水体As3+的研究鲜有报道[15-17]。本研究为了评价细杆菌属去除水溶液中As3+的可行性，优化了该菌的生长条件与As3+吸附条件，并通过吸附动力学与等温吸附试验研究了该菌对As3+的吸附行为，通过SEM-EDX 与FTIR 分析分析了该菌对水体As3+的吸附机理，以期为As 污染的微生物修复提供必要的修复材料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 耐As 细菌的分离

从湖南娄底冷水江矿区采集土样，于4 ℃冰箱保存。称取10.0 g 土样放入100 mL 锥形瓶中并加入100 mL 无菌水，120 r/min 震荡2 h，取出静置15 min。用移液枪吸取200 μL 上清液，采用稀释涂布法[11]接种在As3+浓度为100 mg/L 的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，于28 ℃恒温培养箱培养48 h。挑选形态不同的单菌落进行分离划线，纯化后逐步递增固体平板浓度，筛选出高耐As 菌株。

1.2 耐As 细菌的鉴定

通过16S rRNA 基因测序，引物为27F：5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R：5′- TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。由生工生物工程（上海）股份有限公司完成耐As 菌株的分子生物学鉴定。鉴定结果在NCBI中进行BlAST分析，用MEGA7.0 软件系统构建系统发育树。

1.3 耐As 菌株A4 的生长条件优化

1.3.1 菌株A4 的生长曲线

配置200 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基于250 mL 锥形瓶中，将培育至对数生长期的菌株以2%的接种量接入锥形瓶中，每隔2 h 用紫外可见分光光度计（岛津 UV2600）测定其OD600值分别培养直至48 h，设置3 个平行样，并以未加菌处理为对照（下同）。

1.3.2 不同因素对菌株A4 生长的影响

将高耐砷菌株A4 接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，培养48 h 后离心取湿菌体于80℃烘干至恒质量，再研磨磨细成菌粉待用。

1.4 耐As 细菌的鉴定

配置200 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基于250 mL 锥形瓶中，将培育至对数生长期的菌株以1%的接种量接入锥形瓶中，控制pH 值：5.0、6.0、7.0、 8.0、9.0；转速：90、120、150、180、210 r/min；温度：20、25、30、35、40℃；无机盐：0、0.25、0.50、0.75、1%，每个处理3 个重复，培养24 h，用紫外分光光度计测定其OD600值。

1.5 菌株A4 菌粉对As3+吸附条件的正交优化

采用正交设计优化菌粉对As3+的最佳吸附条件。选择菌粉投加量（g/L）、时间（h）、pH 值与温度（℃）4 个指标各作3 个水平进行正交试验L9（34），具体设计见表1。

通过正交试验设计方案（表1）开展菌粉对As3+的吸附试验。5 000 r/min，1 h 离心后取上清液，并用原子荧光光度计（吉天仪器 AFS-8220）测定滤液中As3+浓度。每个处理3 个重复，并以不加菌处理作为对照。

As3+的吸附量计算公式如下：

式中：q为菌粉对As3+的吸附量，mg/g；m为吸附质质量，g；C0为水中原有As3+浓度，mg/L；Ce为处理后水中剩余As3+浓度，mg/L。

表1 正交试验设计Table 1 Design of orthogonal test

1.6 最佳条件下菌株A4 对As3+的吸附动力学

按正交试验得到的吸附最佳菌粉投加量、pH值、温度于120 r/min 振荡10、20、30、60、90、120、150、180 min 后离心过滤，收集上清液，待测。

1.7 最佳条件下菌株A4 对As3+的等温吸附

按正交试验得到的最佳吸附时间、pH 值、温度，加入菌粉以配制10 mg/ L、50 mg/ L、100 mg/ L、200 mg/ L、400 mg /L、500 mg/ L 浓度的溶液，于120 r/min 振荡后离心过滤，收集上清液，待测。

1.8 菌株A4 对As3+的吸附机理

收集吸附溶液As 后的菌粉，于80 ℃烘干24 h，用研磨磨细样品后，进行SEM-EDX分析与FTIR分析。

1.9 数据计算与分析

吸附动力学研究通过准一阶动力学与准二阶动力学进行拟合；吸附等温研究通过Langmuir 与Freundlich 模型进行拟合。

式中：K1和K2为吸附速率常数，Qe与Qt为平衡溶液As3+浓度与时间t时溶液As3+浓度（mg/g）。

式中：Qe与Qm分别为菌粉对As3+吸附量与最大吸附量，mg/kg；Ce为吸附平衡溶液中As3+浓度，mg/L；KL、KF与n均为吸附常数。

使用Excel 2016 处理试验数据，Origin 9.0 绘制图形。

2 结果与分析

2.1 耐砷菌株的鉴定

从土样中筛出23 种菌株，其固体平板的最小抑菌浓度为40 mmol/L。进一步提高固体平板的As3+浓度至53 mmol/L，最终只有4 株菌株能继续生长。选取其中一株菌命名为A4，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行鉴定，将所得序列在NCBI 网站进行序列同源性比较，用MAGE X 软件构建系统发育树（图1）。耐As 菌株与多株Microbacterium的序列相似性达到99%，可确定耐As 菌株为细杆菌属Microbacterium。通过16S rRNA 基因测序，引物为27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

图1 耐As 菌株的16S rRNA 系统发育树 Fig.1 Phylogenetic tree of arsenic resistant strain

2.2 菌株A4 生长曲线

菌株A4 的生长曲线见图2。由图可知，0 ～ 10 h 为菌株A4 生长的迟缓期，10 ～30 h 为生长对数期，30 ～44 h 为稳定期，44 h 后进入衰亡期。

2.3 菌株A4 生长条件优化

图2 菌株A4 生长曲线Fig.2 Growth curve of bacterial strain A4

温度、pH 值、NaCl 浓度、转速对菌株A4 生长的影响见图3。可以看出，当无机盐浓度低于0.25%时，菌株A4 生长良好，而当无机盐高于0.25%时菌株生长量急剧下降，菌株A4 生长最适无机盐浓度为0.25%。当转速低于180 r/min 时，菌株A4 生长随转速增加呈逐渐升高的趋势，高于180 r/min 时生长量反而下降，菌株A4 生长最适转速为180 r/min。菌株A4 在pH 值为7.0 ～9.0的范围内都能生长，pH 值高于7，菌株生长量明显提升，说明菌株A4 更适合在中性以及弱碱性的环境下生长。此外，菌株A4 生长最适温度为30℃，但在温度为20 ～40℃时皆能生长。

2.4 菌株A4 对As3+吸附条件的正交优化

图3 不同条件下菌株A4 的OD600 值Fig.3 OD600 value of bacterial strain A4 under different conditions

正交试验结果表明（表2），各因素不同水平下的变化趋势范围为IIA＞IA＞IIIA、IIB＞IB＞IIIB、IIIC＞IIC＞IC和ID＞IID＞IIID，表明在各因素所选定范围中，菌株A4 所制菌粉吸附溶液中As3+的最佳条件为A2B2C3D1，即菌粉投加量为0.02 g/L、吸附时间为2 h、pH 值为8.0 和温度为20 ℃，此条件下菌粉对As3+的吸附量为128 mg/g。各因素的极差范围在25 ～147，其中温度最大，说明其对菌粉吸附As3+的影响最大。

2.5 菌株A4 对As3+的吸附动力学研究

菌株A4 对As3+的吸附动力学特征如图4 所示。随着吸附时间的延长，菌株A4 从10 min 到120 min 对的吸附量显著增加，120 min 达到吸附平衡。由表3 可知，准一级动力学相关系数R2（0.989）大于准二级动力学相关系数R2（0.953），说明菌株A4 对As3+的吸附过程符合一级动力学方程，所以菌株A4 最大吸附量为132.5 mg/g。

2.6 菌株A4 对As3+的等温吸附研究

图2 所示为菌株A4 对As3+吸附的L 型（图5 a）和F 型（图5 b）吸附等温线。随着外源添加As3+浓度的增加，菌株A4 对As3+的吸附量呈逐渐上升的趋势。由Langmuir 方程拟合可知，菌株A4 对As3+的最大吸附量达114.6 mg/g，吸附常数KL值为0.016。KL可以表示吸附剂的吸附能力，在0 ～1 之间有利于吸附，KL在0 ～1 之间说明A4 对As3+的吸附容易进行。由Freundlich 方程拟合可知，吸附常数KF与n分别为5.65 和0.52。一般认为，n的数值在0 ～0.5 之间易于吸附，n为0.52说明吸附过程易进行。由图可知，Langmuir 方程所得R2（0.99）优于Freundlich 方程所得R2（0.94），所以A4 对As3+的吸附更符合Langmuir 等温吸附方程，其吸附以单分子层吸附为主。

表2 正交试验设计及结果Table 2 The results of the orthogonal test

图4 菌株A4 对As3+吸附的动力学特征Fig.4 Adsorption kinetics of As3+ onto strain A4 described by pseudo-first order model and pseudo-second order model by curves

表3 菌株A4对As3+吸附的动力学常数Table 3 Kinetic parameters for the sorption of As3+ by stain A4

2.7 菌株A4 对As3+的吸附机理分析

为明确菌株A4 制成菌粉对溶液As3+的吸附机理，利用SEM-EDX 扫描测定了吸附与不吸附As3+时菌粉的表面形态。从图6(a)和6(c)可以发现，未吸附As3+的菌粉表面光滑，呈杆状，菌株A4 菌粉吸附As3+后，表明形态和大小发生了显著变化，具体表现为表面褶皱增多，团粒变大，这也体现了菌株A4 菌粉对溶液中As3+的吸附效应。

此外，通过能谱分析得到了菌株A4 菌粉在无As3+（图6b）和含As3+（图6d）处理下的离子装载情况。结果表明，在无As 处理中，菌粉表面存在C、O、K、P、Pt、Mg、Nb 峰，而在含As 处理中的菌粉存在C、O、As 峰，说明As3+替换了菌粉表面原有的K、Pt、Mg、Nb 离子，并可能与P 元素大量螯合。上述结果也与红外光谱分析结果一致。

图5 菌株A4 对As3+吸附的等温吸附特征Fig.5 Adsorption isotherm fitted by Langmuir model (a) and Freundlich model (b) by curves of As3+ onto strain A4

图6 菌株A4 菌粉吸附As3+前后的扫描电镜与能谱图Fig.6 SEM-EDX images of the bacteria powder of the strain A4: (a), (c) without sorption of As3+, (b), (d)sorption of As3+

图7 为负载As3+和未负载As3+的菌株A4菌粉的红外光谱分析，用以确定可能导致As3+吸附的官能团。如图4 所示，对比未吸附As3+处理，菌粉吸附As3+后，表面-OH、-CHO、-COOH、-NH与O-P-O等功能团变化显著，其中-OH的最大峰峰型变窄，峰值由3 404 cm-1转移至3 385.39 cm-1，这体现了As3+与-OH 的络合作用，而-CHO（2 927.21 cm-1）与-COOH（1 654.93 cm-1）功能团峰强则均有所增加；峰值1 542.04 cm-1和1 452.92 cm-1处为细胞蛋白质酰胺带，受-CN伸展振动与-NH 弯曲振动影响显著，菌粉吸附As3+后，峰强分别转移至1 654.93 cm-1和1 453.11 cm-1；另一个变化是从1 404.75 cm-1到1 400.41 cm-1，此对应了As3+与-NH 基团的螯合效应；在峰值1 238.34 cm-1处，菌粉吸附As3+后峰值转移至1 237.47 cm-1，这可能与As3+与细胞壁中多糖组分中的C-O-C 的结合有关；此外，另一个弱吸收峰强从533.00 cm-1转移至533.68 cm-1，对应多糖的O-P-O 的剪接振动。因此，以上的光谱变化可能是As3+与菌株A4 菌粉上的-OH、-COOH、-NH与酰胺等基团相互作用的结果。

3 讨论

近年来，利用微生物方法处理污染水体中的As 已日趋增多，但菌种类型不同，生长特性存有差异，必然会影响其对As 的去除效率。Podder 等[18]发现耐As 菌株MTCC 4380Bacillus arsenicus的最佳生长pH 为7.0，且对As3+的耐受阈值为1 000 mg/L；Battaglia-Brunet 等[19]经分离得到的耐As菌株DSM 16361 or B6TThiomonas arsenivorans，其生长pH 值范围在4.0 ～7.5，其耐As 能力为100 mg/L。本研究从As 污染矿区土壤分离出一株高耐As 菌株A4Microbacterium，其对As3+的耐受阈值为53 mmol/L，并在pH 值范围5.0 ～7.0时的OD600值显著上升，且在7.0 ～9.0 时平稳增长，体现出A4 菌株对水体环境pH 值的高度适应能力，有利于实际治理工业废水的应用。

图7 菌株A4 菌粉吸附As3+前后的红外光谱图Fig.7 FTIR spectra of the bacteria powder of the strain A4 before and after sorption of As3+

众多研究报道了细菌、真菌及微藻类等对As3+的不同吸附能力。Sari 等[20]利用Langmuir 模型拟合得到无生命的绿藻Maugeotia genuflexa的最大As3+吸附量为57.48 mg/g；Wu 等[20]通过对酵母菌对As3+的吸附试验得到最大As3+吸附量为62.91 μg/g。而Asadi Haris 等[11]从位于北极极寒地区某池塘沉积物中收集到菌种Yersinia sp.，进行了Langmuir 与Freunlich 吸附等温线拟合，并得到该菌株对As3+的最大吸附量为159 mg/g。本研究通过正交试验优化得到菌株A4 所制菌粉在最佳吸附条件下对As3+的吸附量可达128 mg/g，并通过吸附动力学证实了菌粉在120 min 左右时间可达吸附饱和状态，通过Langmuir 方程拟合得到菌株A4 所制菌粉对As3+的最大吸附量为114.6 mg/g，该值虽低于极耐寒菌对As3+的吸附量，但远优于常规生长条件下其它菌种对As3+的吸附能力，因此菌株A4 对As 污染水体As3+的去除潜力是值得肯定的。

为探明菌株A4 所制菌粉对水溶液中As3+的吸附机理，本研究进行了含As3+与不含As3+水溶液下所得菌粉的SEM-EDX 分析与FTIR 分析，结果发现，相比未含As3+溶液所得菌粉，含As3+溶液所得菌粉表面皱褶明显增多，且团粒结构变大，这体现了As3+在菌粉表面的吸附作用。死菌细胞表面往往呈现负电荷并有较多的吸附位点，促进了其对As3+的吸附能力。此外，由能谱图可知（图6c, d）可知，菌粉表面发生了Mg2+与As3+的离子交换作用，此过程亦促进了菌粉对As3+的吸附。大量研究表明，死细菌的细胞壁与代谢产物会暴露大量活性基团如羧基、羟基、氨基等，这是菌粉吸附As3+的重要机制[21-22]。本研究表明：菌株A4 细胞壁上的的-OH、-COOH、-NH 与酰胺等基团与As3+发生了络合作用，实现了菌粉对As3+的吸附效应。

综上所述，菌株A4 对水体As3+的吸附能力为水体环境容量提供了正效应，对后续As 污染水体的微生物治理具有理论与指导意义。未来可继续探究在不同改性条件下该菌粉对As3+吸附效果有何变化或该菌粉对不同重金属的吸附特征与机理，以完善水体重金属污染微生物治理方法体系。