环状RNA在类风湿性关节炎中医证候中的研究进展

★ 卢黄欣 刘萍 李玮婷 杨军平（.江西中医药大学 南昌 0004；. 南昌大学 南昌 0004；.江西中医药大学附属医院 南昌 0006）

类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一类以慢性滑膜炎为特征的全身性自身免疫疾病，从属中医学“痹病”“痹证”范畴，又有“骨痹”“尪痹”“白虎历节”“鹤膝风”等称谓。RA在老年疾病中患病率极高，后期容易诱发严重并发症，并易致残，末期患者生活质量大大降低，因此一直是风湿免疫病研究重点。目前对本病的病因和发病机制的研究取得较大进展，但认识尚不全面，且临床治疗效果局限。中医对该病的本质及诊疗有独特见解，其中，《中华人民共和国中医药行业标准·中医病证诊断疗效标准》将尪痹证候分为风湿热郁、风寒湿阻、气血亏虚、肾虚寒凝、肝肾阴虚、痰瘀互结六种证型［1］，根据中医临床证候分型及辨证论治，其疗效较佳［2］，其中关于辨证论治的生物学基础研究较多，但尚未形成规范化的证候诊断标准。随着系统生物学研究不断推进，环状RNA与RA关系被逐步阐明，其中越来越多的研究者已然认识到环状RNA在分子生物水平上以不同的作用机制对RA的发生发展产生巨大影响。同时，环状RNA所具备的稳定性、保守性、时空特异性和组织特异性等特性可为证候研究提供思路。因此从环状RNA角度来构建出与类风湿性关节炎中医证候相关的环状RNA来寻找特异性证候生物学标志谱具有较高的科学研究意义。本文通过对环状RNA在类风湿性关节炎和中医证候中的研究进展进行综述，探讨环状RNA在类风湿性关节炎及其中医证候研究中的潜在临床应用。

1 circRNA概述

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类缺乏典型3’端polyA尾和5’端帽子结构、并具有共价键闭合环状结构的内源性非编码RNA。在1976年，circRNA首次在植物类病毒中发现［3］，后来又发现其在真核生物中广泛存在。circRNA在被发现的短期内一直被认为代表剪接错误的副产物，并认为其低丰度存在。直到近期，circRNA的特点及生物学功能不断被挖掘，证明其发现在人类疾病中发挥重要作用。越来越多的研究表明，circRNA种类繁多，数量丰富［4］，并且具有细胞类型特异性，在造血细胞，血小板，红细胞中差异表达，且在成熟过程中其种类和数量会发生变化［5］。不仅如此，circRNA在组织、疾病、种属间具有特异性［6-7］；同时，circRNA不同于线性RNA，对核酸外切酶识别不敏感，更具保守性和稳定性［8］。深入研究发现，circRNA具有多种生物学功能，比如：可通过海绵状的吸附miRNA［9-10］，或通过调节RNA结合蛋白相互作用参与RNA、蛋白质的存储和转运［11-12］，并发挥着调控基因转录作用［13］，以及直接翻译成蛋白质［14-15］。其中CircRNA可通过充当miRNA海绵调节许多生物学过程，包括DNA甲基化、免疫反应和炎症反应，促进疾病的发展。同时，因免疫细胞中的circRNA的多种生物学功能性，而在自身免疫性疾病中起到重要治疗作用［16-17］。

2 类风湿性关节炎中医证候研究

在RA疾病治疗中，传统中医学充分发挥病证结合、辨证论治的特点，具有独特的优势。其中中医证候的规范化诊断对其治疗效果尤为重要。在对RA证候分型研究中，学者认为RA具有独特的证候学特征，但辨证分型多样，证素相对简约，而证素可通过排列组合形成证候，从而建立以证素为核心的辨证诊疗体系［18］。其中也有学者综合应用多元统计分析方法探讨RA症状、舌脉与常见中医证候之间的关系，使今后的证候诊断及临床辨证更加客观化［19-20］。然而，目前RA证候庞杂，证型多样，在临床上辨证施治时欠缺规范、标准的证候诊断体系，所以明确证候诊断极其重要。其中在证候初期研究中，学者主要围绕证候的分类、命名、诊断标准以及与现代医学指标相关性、分型指导现代医学临床决策等内容展开研究，但对证候的实质认识始终模糊不清。其中20世纪80年代“微观辨证”的提出，将中医经典辨证论治的视野扩展到神经递质、免疫甚至基因调节，为中医证候诊断标准提供了新的指导意义。由于中医证候是一个“动态时空”“内实外虚”“多维多阶”的复杂系统［21］，具有动态性、整体性、非线性等特点，只有将系统生物学引入到证候研究中，才能探讨其实质，使证候更具科学性及客观性。其中，为探索证候本质及明确诊断标准，学者将研究重点转向系统生物学，目前已有大量学者从代谢组学、转录组学、蛋白质组学等［22-23］不同角度揭示RA中医证候实质，为明确证候诊断标准提供科学依据。其中，研究者的思路并不局限于局部观和线性思维，而是转向整体观和复杂思维的基因组学研究来探究证候的本质［24］，并取得一定进展。根据基因芯片技术和高通量测序技术的提出与应用，以及对其技术结果进行生物信息学和统计学的比较分析，筛选出疾病证型特定的表达基因，为中医的微观化研究提供了新思路。尽管目前从cicrRNA角度进行证候研究鲜有报道，但将cicrRNA应用到中医证候微观辨证研究中，仍大有作为，可为指导临床诊断及治疗提供理论依据。

3 circRNA在类风湿性关节炎中的应用

circRNA是人类疾病表观遗传调控的关键因素，其中表观遗传的失调可直接影响自身免疫性疾病的发生发展及免疫细胞功能［25］。目前大量研究表明circRNA在分子生物水平上广泛参与类风湿性关节炎的发生发展［26］。

3.1 参与发病机制 RA的主要特征就是类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞（rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASFs）大量增生，进而对关节软骨及骨组织造成进行性破坏。目前大量研究表明，miRNA广泛参与调控RASFs增殖、RASFs凋亡及RASF侵袭，同时miRNA异常表达可导致自身免疫耐受机制受损。CircRNA是竞争性内源性RNA网络的一部分，被认为是miRNA海绵，在许多疾病的发展中起着至关重要的作用。研究发现hsa-miR-125a-3p是由其他研究实验证实的has-circ-0005397靶向的miRNA［27］，可能参与类风湿性关节炎的发生发展。同时也有研究表明has-circ-0001859可以与转录因子2（ATF2）竞争miR-204/211，has-circ-0001859的下调抑制了SW982细胞ATF2的表达，降低炎症活性，从而参与了滑膜组织的慢性炎症过程［28］。除此以外，Tang等［29］研究发现介导CDR1反义稳态调节的miR-671在RA患者中的相对表达显著降低，其下调可影响RA患者ciRS-7的水平。研究中明显增加的ciRS-7可抑制miR-7的功能，进一步减轻miR-7对mTOR的抑制作用，从而参与RA的发生。

3.2 作为生物分子标志物 早期诊断对人类疾病治疗与预后尤为重要，寻找早期诊断的方法一直是研究热点。circRNA特殊的闭合环状结构且不易降解的特点决定其在进化过程中更具稳定性，并且大量存在于血液和唾液等其他生物液体中［30-31］；同时，有研究表明circRNA在不同组织、种属和疾病中具有特异性，表明其在生物学标志物领域具有潜在作用。目前关于circRNA的生物标志物功能研究主要集中于心血管疾病及各类肿瘤等疾病中，随着相关技术的推进，此功能在类风湿性关节炎中也得到体现。Zheng等［32］通过circRNA芯片发现RA患者与健康对照组共表达差异表达circRNA584个，其中255个circRNA显著上调，329个circRNA显著下调，采用qRT-PCR结果显示hsa_circ_0088088和hsa_circ_0038644表达显著下调，hsa_circ_0092285、hsa_circ_0058794表达显著上调，对RA的诊断及治疗提供了一个崭新的方向。Ouyang等［33］通过circRNA微阵列筛选5名RA患者和5名健康对照者的PBMCs中发现circRNA_104871、circRNA_003524、circRNA_101873、circRNA_103047显著升高，并通过ROC曲线分析显示circRNA_104871对RA诊断有显著价值。杨璇等［34］采用高通量测序技术发现4例RA患者和3例健康对照组PBMC中共有71种显著差异表达的circRNAs，其中41种上调，30种下调，生物信息学分析显示，涉及的通路多与炎症和转录活性相关。经实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示hsa_circ_0000396和hsa_circ_0130438在RA患者PBMCs中的表达水平显著下调，其中，ROC曲线分析进一步表明显示hsa_circ_0000396有望成为RA诊断分子标志物。同时，外周血中hsa_circ_0002715和hsa_circ_0035197的组合被证实可能是新发RA患者的潜在生物标志物［35］。

3.3 反应疾病严重性 随着研究推进，众多研究者发现circRNA的表达与疾病的检验指标存在显著相关性，可反应疾病严重性或活性。了解疾病严重程度可对患者病情进行更准确的评估，避免严重并发症，进而有利于患者后续治疗及预后。研究者发现RA患者PBMC中hsa_circ_0000175的表达与抗枸橼酸蛋白抗体、淋巴细胞/中性粒细胞百分率、白细胞/淋巴细胞/中性粒细胞计数、中性粒细胞与淋巴细胞比值相关［36］；PBMC中hsa_circ_0008410表达与关节活动度、血小板压积、血小板计数、病程有关［36］；外周血中hsa_circ_0002715［35］表达水平与关节肿胀计数（SJC）、抗环瓜氨酸蛋白抗体（ACPA）、关节压痛计数（TJC）、血液病、类风湿因子（RF）、病程相关；外周血中hsa_circ_0035197表达水平与血液病相关［35］；以及在WEN的研究中发现RA患者血清hsa-circ_0001200水平与CCP水平呈正相关［37］，hsa-circ_0001566水平与CCP呈正相关，与IGA呈负相关，hsa-circ_0003972与DAS28、关节压痛呈正相关，hsa-circ_0008360水平与CCP呈负相关，均表明异常表达的circRNA与RA的疾病活性和严重程度相关。

4 circRNA与类风湿性关节炎中医证候相关性

“证”不仅包括“望、闻、问、切”四诊所了解的宏观指标，还包括微观信息。作为中医诊断基本原理之一，“见微知著”即通过对细微变化的观察，可以测知整体的状况。“微观辨证”应同“宏观辨证”相结合，在传统中医辨证施治理论的指导下，对“证”的诊断统一规范化起辅助作用。在中医证候的微观研究中，掌握好中医整体观念与微观指标的联系，结合证候的模糊性与微观信息的准确性是研究中应重视的部分。微观研究是探索中医证候内涵与实质的途径之一，其中不少学者利用病证结合的方法，通过应用转录组、蛋白组、基因组的差异信息，建立“异病同证”“同病异证”的生物学基础和潜在的生物标志物［38］。众所周知，“异病同证”即不同疾病，即使存在个体差异、季节差异、地区或气候改变，却有相同的症状，“证”的属性就相同，即具有共同的病理机制；同病异证指同一疾病因个体差异及环境因素不一致，从而“证”的属性不同。学者根据这一中医理论知识，将目光转向circRNA与中医证候相关性研究，但目前应用circRNA芯片技术和高通量测序技术探索circRNA和RA中医证候相关性的研究较少，而将circRNA引入到中医证候研究中，优势颇多，如：（1）circRNA具有较强的疾病特异性、组织特异性，与中医“同病异证”“异病同证”有一定联系；（2）circRNA表达的时空特异性与中医证候的动态时空特异性相似；（3）circRNA广泛存在于血液、唾液和其他生物体液中，且种类繁多，其差异性表达可一定程度体现中医的整体观；（4）目前关于circRNA的发现与命名较少，其基因表达相对证候复杂性比例较小，将circRNA应用到证候研究，更易开展实施，有利于研究的进一步深入进行。总之，从circRNA角度建立与中医证候间的联系，可加深目前对中医证候机制的理解，并为进一步研究中医理论的分子基础提供基础，进而为传统中医精准辨证论治提供科学依据。

目前有学者筛选RA及其他疾病气滞血瘀证型（QSBSS）患者异常表达的circRNA，探讨circRNA在证候研究中的作用。Chen［39］通过测序技术获得circRNA表达谱，并与类风湿性关节炎、冠心病、慢性胃炎气滞血瘀证型患者及正常对照组进行比较，发现2个circRNA有显著差异表达；并对其进行生物信息学分析表明，QSBSS中差异表达的RNA最显著的富集途径是鞘脂类信号通路、神经营养蛋白信号通路和内吞作用，此外，网络药理学分析表明，几种差异表达的RNA被纳入了中药治疗QSBSS的靶点。同时，在高嘉良［40］的研究中，同样选取类风湿性关节炎、冠心病、慢性胃炎气滞血瘀证型患者和冠心病非气滞血瘀证型患者以及健康人群共25例，分为5组，并通过高通量测序技术，在25例样本中共检测到25059个circRNA。其中circRNA_24450、circRNA_18046、circRNA_11523、circRNA_09849在气滞血瘀证型中差异表达。这些研究提示不同疾病在同一证候中cicrRNA有差异性表达，不仅为中医证候生物学基础研究做出新贡献，并使中医临床诊断更加客观化，但目前关于cicrRNA在同一疾病不同证候的差异表达鲜有报道。随着不同疾病同一证型cicrRNA表达的研究不断深入，其同一疾病不同证型的cicrRNA表达研究亦具有可行性。

5 展望

中医证候的生物学基础研究是中医证候现代化研究中的一大方向，其中寻找中医证候分子生物学标志物是中医证候生物学基础研究的重点所在。自从circRNA被发现以来，科研人员在RA方面已做大量研究，但是circRNA与RA中医证候相关性研究较少。将circRNA引入RA中医证候研究，探索中医证候特定基因谱可为我们研究证候生物学基础及寻找证候生物标志物提供新的切入点，并使RA中医证候诊断和辨证论治更具科学性，同时可为古代方剂的优化和新药物的发现提供新的思路，并为中医理论的发展和医疗医疗保健的改善铺平道路。但是，目前关于circRNA的研究处于初期阶段，以及由于临床诊断的局限性和脱靶效应，将circRNA整合于临床实践中并有效应用仍面临很多问题。因此，需进一步验证circRNA的功能，并发挥其临床应用价值。例如：（1）进行实验验证时增加样本量和样本类型，降低偶然性；（2）分析检测circRNA的最佳血液成分；（3）统一circRNA的命名；（4）简化并标准circRNA检测方法。相信随着相关研究的不断推进，circRNA不仅广泛参与RA的发生发展，亦能基于circRNA异常表达寻求RA证候分型标志物，也能为中医药诊治RA做出贡献。