血瘀证动物模型研究现状及评价分析

★ 陈常莲 舒昀 程娜 李中炼 华诗培 谭子剑 罗小泉 龚美富*（1.江西中医药大学附属医院 南昌 0006；.广州中医药大学 广州 510006；.江西中医药大学 南昌 0004）

证候研究是中医基础理论研究的重要领域，是临床治疗和科学研究的基础和前提。要深入探究中医证候的病因病机理论，需要借助于中医证候动物模型。中医证候动物模型是在中医药理论的指导下，在动物身上模拟出人类疾病证候的某些特征，制备出与人类疾病症状和病理变化相似或相同的动物模型［1］。

血瘀证是现代中西医结合研究中最活跃的领域之一。中医认为血瘀证是指离经之血不能及时排出或消散而停留在人体的某部，或血液运行不畅瘀积于经脉或器官内所出现的证候，且把痰凝、寒邪和情志失调认作为主要的致病因素。其四大主症包括疼痛、肿块、瘀斑、出血。

血瘀证动物模型是活血化瘀疗法研究的重要基础平台，可以客观地表征中医药的安全性及有效性。目前血瘀证动物模型主要有以下三类：中医病因动物模型、西医病理动物模型及病证结合动物模型。尽管人们在模型研究方面做了大量的探索性工作，取得了不小的成绩，但也存在诸如造模因素过于简单、过于注重实验室指标的变化而相对忽视外在客观表征的观察等问题。下面就血瘀证模型存在的问题、造模方法、评价体系及研究发展方向等方面逐一做简要分析。

1 血瘀证动物模型存在的问题

1.1 缺乏理想的病证结合动物模型 虽然目前已有不少气滞、气虚、寒凝、痰浊等血瘀证候动物模型的相关研究，但新模型的报道较少，中医血瘀证动物模型基本处于发展到一定阶段后的停滞状态，所获研究数据主要为成果判断，少见动态观察血瘀过程的研究报道。中医学病因与疾病之间的关系是非特异性的，导致中医证候动物模型难以复制、难以验证。如采用多因素造模（如游泳、控制饮食、惊恐、寒湿）尽管可模拟人们所需的证候，但人为因素较多，模型制作过程复杂，实验的可操作性及稳定性较差。如果在多因素造模基础上再造疾病模型来制作病证结合动物模型。这样从理论上讲既符合中医理论，又符合临床实际，但实验动物往往难以承受接二连三的打击，死亡率高，实验的可行性差［2］。由于血瘀证常以其他兼证形式出现，且血瘀证常为复杂的虚实夹杂的证型，在不同阶段常出现不同证型的转换［3］，故很难找到理想稳定的病证结合动物模型。

1.2 造模因素过于简单导致模型的中医证候特点不强 由于中医学存在“一因多证”和“一证多因”现象及中医病因概念自身的模糊性，综合性病因与机体内在因素通过一段时间相互作用才会导致中医临床复杂证候，在致病因素停止作用后形成的血瘀证持续时间较短暂，与临床血瘀证有一定的差距，从而使血瘀证模型变成了急性模型。根据中医“久病成瘀”的理论，“血瘀证”并不是单一原因造成的急性病证，其形成是多元病因所致的一个长期复杂的慢性过程。短时间建立的证候动物模型与人体长时间积累所发现的中医疾病证候有别，只有深入探索发病机制，从发病机制着手研究才能无限接近血瘀证动物模型［4］。由于患者的临床表现差异较大，目前只能模拟出患者的主要症状，但也有模型不易表达的症状，所表达出的症状和临床的匹配度极低，缺乏个体化证候疗效评价方法及研究实例。况且从动物实验结果推论到人体受到一定局限，很难从整体上完全模拟疾病。因此并不是所有人类致病因素都能在实验动物身上复制出相应的证候模型。加之实验动物局部的病理损伤、静态的指标水平，这与人体证候的整体性和动态性相距甚远。证候动物模型作为一个整体才是最本质的反映，也是临床和科研的论治点。将复杂的中医病因抽象比拟为一两种干预方式，造模后动物的病理状态难以完全等同于中医证候的特征，未能模拟出传统的中医病因，违背了中医的病因病机理论。若用西医造模的方法来建立中医动物模型，用西医的思维来探讨中医的理论，用西医的标准来规范中医，长久则会使中医处于被动地位，不利于中医的发展。

1.3 缺乏标准化、规范化的判定标准 一个成功的中医血瘀证模型应既符合血瘀证的临床诊断标准，又有较公认的病理生理指标，用活血化瘀代表方剂治疗可使血瘀证状得到改善。目前血瘀证动物模型的评价标准与临床检测指标相比往往太过单一，缺乏规范化的评价体系。模型制作条件较难控制，致病因素的强度、时间难以标准化处理。模型证的属性判断模糊，同病异证，异病同证。造模工具、操作方法不统一，实验动物个体差异性，影响了模型的有效性。造模因素过于纯化模型种类不足使模型在实际应用中广受质疑。临床研究和治疗大都停留在外部宏观手段和技术上，很难对证型发展的微观改变及证型演变规律进行深入系统的了解［5］。客观指标与证候缺乏微观联系，实验室指标的改变与证候的关系尚不明确。客观指标评价的大多是病，而非证。客观指标与微观指标关联的建立目前处于瓶颈阶段，现有条件难以实现动物四诊信息的客观化，少有实验者会严格按照四诊进行详细的信息采集，而是选择一些典型易观察的症状作为评价标准。一些主观判断的症状缺乏量化标准，模型的复制与评价具有很大的人为倾向性，不细心观察外部表征，仅以实验室指标，其说服力是不够的。

2 血瘀证动物模型的建立

建立稳定、经典、实用的血瘀证动物模型是深入研究中医血瘀证候的发生发展过程、中医药物干预及治疗效果的基础与前提，一是拟定的干预因素是所造证候的主要影响因子，二是采用拟定的干预因素所致的病理变化应当是所造的证候［6］。血瘀证动物模型的建立需要在理论上可行、在实践上可操作，且能模拟临床诊治思维，既体现标准化中医动物模型的复制，也遵守实验动物制作标准作业程序。血瘀证动物模型的造模方法层出不穷，既有全身性的，又有局部性的，既有单一的，也有病证结合的。不同造模方法所致的动物模型成模的标准可能有差异、成模时间也不同，首先应选用几种经典的造模方法，优先选择与人体病理生理特点相近的实验动物，主要有大鼠、小鼠，其次还有兔子。这符合中医病因病机要求，以增加实验在临床应用的可靠性，并严格按照制备方法进行制作，制备出既符合中医理论、贴近血瘀证候特点，又具有稳定性、实用性的经典动物模型。中医病因致病特异性不强，通常模拟这些不同的致病因素进行造模，通过合理的培育手段，优选纯化造模因素，使造模因素和中医病因相符合。单因素造模，方法简单，较为片面，条件单一便于控制；多因素叠加造模，主要通过干预饮食、情绪、环境等方面进行，采用多种因素综合作用增加血瘀证模型的典型性，概括了相关检验指标和不同造模方法的特点，缺点是模型稳定性和代表性较弱，不利于证候的因果关系分析。对于致病因素要考虑中医的整体观，不能片面理解中医病因学说，一是模型与原型有相似关系，二是致病机制、病理表现能替代原型，三是研究模型能得到原型信息［7］。我们应结合动物与人共同的生理病理特性，避免人工给动物建立外部环境，尽量减少人工和自然环境模拟造模所出现偏差，让动物从自身内部模拟发病过程。判断模型动物建立成功的基本标志是造模后动物机体的变化能反映出患者病证的真实状态，关键在于成功复制与临床疾病证候相一致的模型，只要出现与证型一致的临床症状且对症治疗疗效确切，就可考虑模型成立。

2.1 中医病因动物模型 中医病因动物模型具有不可控性和非特异性的特点，包括气滞血瘀、气虚血瘀、寒凝血瘀、痰浊血瘀、情志致瘀、外伤致瘀、热毒致瘀、血虚致瘀、外伤致瘀动物模型等。以气滞血瘀证为例，《灵枢·五变》云：“怒则气上逆，胸中蓄积，血气逆流，血脉不行。”“气为血之帅，血为气之母”，气血失常以“有余于气，不足于血”为主。气滞证的病机与抑郁症病例状态相近，多由情志不畅或外邪侵袭引起肝气久郁不解所致。实验过程中可以采用慢性的不可预知性刺激作用可以使动物长期处于应激状态，引起许多消极被动反应，改变动物生理状态，以达到造模条件。梁耀月等［8］比较评价了采用高脂饲料、慢性刺激、高脂饲料及慢性刺激叠加造成的痰浊血瘀、气滞血瘀、痰浊气滞血瘀大鼠模型。结果表明高脂饲料及慢性刺激叠加更符合临床中医证候的表现，提示高脂喂养叠加慢性不可预知刺激情志损伤造成的痰浊气滞血瘀模型更适合血瘀证及相关药物的研究。

2.2 西医病理动物模型 虽然西医病理动物模型具有稳定性和客观性的特点，且多采用现代医学思路，注重模型动物组织、器官或全身的病理损害，使模型较纯化。但西医血瘀证病理模型仍然存在病理轻重、深浅的不同层次。从病理程度上来说，有血流不畅和瘀滞不行之不同，还有脉中血行不畅或溢于脉外的的多种交织。从发展上来看，有血瘀、血瘀气滞及痰瘀互结等病理之别。李莹等［9］采用水环境小平台法进行睡眠剥夺1周后行多发性脑梗死手术，术后继续睡眠剥夺4周造模，结果模型组大鼠毛发枯黄，精神萎靡，静卧懒动，便溏，行为出现障碍，脑组织形态结构出现明显的病理性改变，且随造模时间的延长情况愈加严重。张蕊等［10］观察舒脑欣滴丸对不同血小板聚集诱导剂引起的大鼠血小板聚集影响；通过检测血液流变学指标、凝血功能评价舒脑欣滴丸对血瘀模型大鼠的作用。

西医病理模型多是模拟西医学的血管病理，如血管内皮损伤、阻塞和血液生理病理制成的模型，且其客观量化检测指标多局限于微循环、血液流变学方面，与某些血瘀型专科疾病如心脑血管病、神经内分泌疾病、外伤科疾病、免疫异常、肿瘤等临床各科疾病缺乏直接的相关性。加之其又缺乏辨证论治，与中医理论脱节，不利于中医证候本质的研究。因此，血瘀证西医病理动物模型并不是研究血瘀证理想的动物模型。

2.3 病证结合动物模型 病证结合动物模型多为西医的“病”与中医的“证”相结合，体现了微观指标与宏观信息的统一。既可病证同造，亦可先病后证，增加了模型变量，使很多“证”的不确定因素由于“病”的限制变得更加清晰。一般从病到证，先建立疾病模型，再根据所需中医证候叠加干预因素，使动物模型同时具有西医疾病和中医证候的双重特征。谭辉等［11］采用线栓法结合多因素老龄、饥饿、疲劳、高脂饮食、低氧等方法复合模拟制备气虚血瘀证模型。该模型既出现了脑缺血的病理表现，又具备中医气虚血瘀证的生物学特征。郭文鹤等［12］采用冰水浴、灌胃脂肪乳及尾静脉注射牛血清蛋白复合诱导方法连续造模21周，建立模拟临床动脉粥样硬化（气滞血瘀证）的大鼠模型。该模型具备成模率高成模均匀、与临床症状和体征表现相近等特点，且制备方法基于内皮细胞损伤和血脂异常这一公认的发病机制，并结合AS、气滞血瘀证的病因病机。

病证结合动物模型是未来研究思路和方法的最佳选择。由于“证”的不确定性以及在疾病发展中的过程性，病症结合模型还需要更多考虑病与证的结合点，才能更加准确的表达病因、病理与临床症状。同时病证结合动物模型还应从简单的外部造模手段的病证结合向病证本质的内在联系发展，这样才有可能实现在理论研究上的创新和突破。

3 血瘀证动物模型的评价

中医评价标准指标量化验证，缺乏特异性、敏感性指标，实验动物自身难以表述主观感受，在现代医学中没有明确血瘀证的实验室指标参考值，评价标准也因不同的造模因素而有一定的差异性。我们只能通过外在表征、实验室指标和方药反证来进行证候诊断，通过各项指标综合分析，可以判断模型动物的血瘀程度。模型评价标准的建立有助于指导中药干预的最佳时间，也有利于评定药物疗效。基于宏观与微观指标，以单因素变动原则，尝试建立不同类型血瘀证动物模型的评价标准，确定每种模型的最佳时间窗口期。通过正证和反证形成评价标准，然后再次应用于证候动物模型研究检验，修正证候评价标准。建立规范的符合中医特色的评价体系，因疾病干预与证候干预的时间先后、因疾病证候类型而异进行系统综合评价，使评价趋于客观化、标准化、规范化。

3.1 实验动物的表征 中医倡导“有诸内必行诸外”的整体观念，可以通过肉眼观察模型动物的外观症状与体征，挖掘动物身上具有诊断意义的表征。寻找四诊范围内的相似性，四诊合参，纳入实验室一系列指标，建立量化指标的评分标准，对模型进行恰当的辨证诊断，如舌象、唇象、爪象、耳轮、尾尖、眼球、皮毛、质量、动物行为等一系列生物表征。血瘀证动物模型表征的评价可以参考临床血瘀证的诊断标准，如局部肿痛、眼结膜血管明显扩张充血、唇周发黑、舌暗红等。症状与致病因素有一定的相关性，但并非特定关联性，由于缺乏正常实验动物的系统表征信息数据，会影响疾病模型的证候判断。我们应注重实验动物的信息采集及系统分析，建立了小鼠、大鼠四诊工作站，监测中医证候指标，包括症状、体征、舌象、脉象等。

3.2 实验室检测 目前，血瘀证动物模型有50种之多，这在一定程度上说明在血瘀证造模方法和评价标准方面还没有达成共识。因此，我们应选择特异性强、相关性好的客观实验室指标进行检测。借助实验室检测这样一种重要的辅助诊断手段可较客观地反映血瘀证动物模型是否造模成功。如动物模型其全血黏度、血浆黏度增高，血小板机能增强，凝血机能亢进，微循环障碍等血液流变异常；血流速度和血流量降低等血液动力学障碍；内皮细胞损伤诱导血小板聚集或血管壁通透性增高，血浆大量渗出使血液增黏、增浓、增聚等微循环障碍等以上三种情况之一，均认为该模型是一个成功的血瘀证动物模型。

3.3 重视方药反证 正所谓“无证不血瘀，无药不活血”，依据“方证相应”原理，选择最适宜的方药进行反证，这是一种逆向辨证思维。测证的方药若能使模型动物的症状或体征好转或恢复正常，便可推知证候属性。但由于“一证多方”的现象，缺乏阴性对照和阳性对照，难以保证该方药在治疗特定证时具有排他性或特异性，导致该法存在方法学重要缺陷或缺如。我们需探讨证候与方药相关靶点相互作用的实质研究，统一所选方药的标准化和方药与证候的对应关系。

4 血瘀证动物模型的研究展望

基础研究的目的不是简单的机制研究及发表论文，应与临床实践相结合。医学研究的最终目的是防病治病、延长生命［13］。以“整体”为特点的中医药和以“系统”为特征的现代医疗存在差异，现代医学对血瘀的研究已经从实验生化检测等客观指标逐步深入到细胞、分子等微观水平。在中医实验动物模型的研究过程中出现了不少问题，在模型建立与评价中病证的关联性不紧密，模型的多重性，评价标准局限。往往将疾病和证候两套评价标准简单整合在同一动物模型上，忽视了疾病与证候之间的关联性，并未挖掘到内在联系与本质特征，故建模应以二者在临床上的结合点为基础，才能真实反映病证结合动物模型的内涵。要想成功造模，在临床揭示了血瘀证的细胞和分子病理机制后，应先对传统宏观诊断进行量化研究，然后将微观指标纳入，才有望建立模型的基础与支撑点。在研究中可以通过顶层设计、操作实施、质量考核三个阶段，不施加人为因素，注意动物造模时间的长短及客观指标实验评价时间点的选择，整体把握中医证候的节段性与动态变化，借助多学科力量，综合采用先进的技术手段获取实验数据。在疾病发展过程中证候可能会有变化，要及时动态地对证候属性进行确定，统一同一证候的造模方法、干预措施、时间、强度，加强病证结合模型的比较医学研究，确保“病”与“证”的层面的有效结合。

随着基因工程和代谢组学等先进技术的引入，证候表征模型研究已经逐渐接近临床诊疗模式，很多证候的特异性指标得以被发现，使其实验结果更具说服力。转基因动物模型的成本较高，自然病态性动物模型已成为新趋势，来源有限，价格昂贵，不适合大规模开展，有些证候并不能自然形成，实际应用中受限，但仍有很多科研者致力于此类尖端的生物医学研究。证候研究正在从整体评价向个体评价转变，从单一化向多元化发展，如何将模型动物身上的外在征象信息与辨证诊疗指标进行转换，一直是难点。中医血瘀证实验动物模型的研究必须在传统中医药理论的指导下进行，需要造模技术手段和思维方式的创新，建立与传统中医理论与特色相适应的手段，否则，模型便成了无源之水。动物表征信息丰富，大量信息有待进一步挖掘，这为传统中医药的血瘀证候动物模型提供有效的研究思路和方法。必将实现传统中医学过渡到现代医学的目标，最终加快推进了中西医的有效结合及中医药现代化的步伐的目标。