脂联素通过AMPK/mTOR/4EBP1通路对子宫内膜癌细胞迁移及侵袭的影响

隆曜先，王毛毛，蔡志福，张洁清，李 力

广西医科大学附属肿瘤医院妇科，广西 南宁 530021

脂联素（adiponectin，APN）是一种内源性生物活性多肽或蛋白质，由脂肪细胞分泌，并大量存在于血液循环中［1-2］。有研究发现，APN对胰岛素有增敏作用［3-4］，并与子宫内膜癌细胞的发生、发展呈负相关［5-6］。然而，APN影响子宫内膜癌的机制尚未明确。本研究通过探讨APN对HEC-1B细胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/磷酸化真核启动因子4E结合蛋白1（4E binding protein 1，4EBP1）信号通路的影响，检测B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）与基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）mRNA及蛋白的表达，以及APN对HEC-1B细胞侵袭能力的影响，为子宫内膜癌的诊治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及细胞株

人子宫内膜癌细胞株HEC-1B（雌激素受体弱阳性）购自北京大学。重组人APN购自捷克Biovendor公司；反转录检测试剂盒购自美国Fermentas公司；实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）技术检测试剂盒购自日本TaKaRa公司；复合物C（AMPK抑制剂）购自德国Calbiochem公司；兔抗人AMPK和磷酸化AMPK（phosphorylate-AMPK，p-AMPK）单克隆抗体、兔抗人mTOR和磷酸化mTOR（phosphorylate-mTOR，p-mTOR）多克隆抗体、兔抗人4EBP1和磷酸化4EBP1（phosphorylate-4EBP1，p-4EBP1）单克隆抗体、兔抗人磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自美国Cell Signaling公司。

1.2 细胞培养及分组

将HEC-1B细胞加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中并置于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培育及传代，取对数生长期细胞进行后续实验。相关文献［7-8］及本实验前期研究［9］发现，20 μg/mL APN作用30 min是最佳浓度与时间，因此后续实验皆以该数据进行实验。实验分为4组：

①对照组：仅加入无血清DMEM培养基；② APN组：20 μg/mL APN作用于细胞30 min；③抑制剂组：10 μmol/L复合物C作用于细胞30 min；④ APN+抑制剂组：10 μmol/L复合物C预处理细胞30 min后，加入20 μg/mL APN作用30 min。

1.3 RTFQ-PCR检测细胞Bcl-2、MMP-9 mRNA的表达

用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，反转录合成cDNA，进行RTFQ-PCR检测。根据引物设计原则设计引物序列。Bcl-2上游引物为：5’-TTGGATCAGGGAGTTGGAAG-3’，下游引物为：5’-TGTCCCTACCAACCAGAA GG-3’，扩增长度片段为295 bp；MMP-9上游引物为：5’-ACGCACGACGTCTTCCAGTA-3’，下游引物为：5’-CCACCTGGTTCAACTCACTC C-3’，扩增长度片段为94 bp；内参GAPDH上游引物为：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAG TC-3’，下游引物为：5’-GAAGATGGTGATG GGATTTC-3’，扩增长度片段为246 bp。PCR反应体系：DNA荧光染料SYB-R Green 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，反转录产物2 μL，ddH2O 6.4 μL，总体积20 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s；60 ℃退火延伸30 s，循环40次。实验重复3次。

1.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测蛋白水平

用含有苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的蛋白裂解液于冰上裂解收集各组细胞蛋白，并用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定每个蛋白样品的蛋白浓度。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离100 μg蛋白，将电泳产物转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭PVDF膜1 h，分别加入一抗AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、Bcl-2、MMP-9（浓度均为1∶1000），4 ℃摇床温育过夜。第2天取出PVDF膜置于含有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗兔二抗的离心管中，室温温育1.5 h。含0.05%吐温20的洗膜缓冲液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗膜3次，每次10 min，ECL化学发光扫膜并分析数据。使用Image-Lab软件分析灰度值数据，以GAPDH作为内参照，AMPK蛋白活化水平以p-AMPK/AMPK比值表示，mTOR活化水平以pmTOR/mTOR比值表示，4EBP1活化水平以p-4EBP1/4EBP1比值表示。实验重复3次。

1.5 细胞体外穿膜实验检测细胞迁移能力

无血清培养基重悬各组细胞使细胞密度为105/mL，100 μL细胞悬液接种于Transwell小室上室每孔中；下室每孔加入600 μL 20%胎牛血清培养基，在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h。将小室放入4%多聚甲醛中，使小室滤膜底面充分浸泡在其中，固定30 min。吉姆萨染色后在200倍显微镜下观察，随机取5个视野拍照。计算5个视野迁移细胞数的平均值。实验重复3次。

1.6 划痕实验检测细胞侵袭能力

将子宫内膜癌细胞接种于6孔板中，待细胞达到80%～90%融合时，吸掉培养基并用PBS冲洗细胞3次，用10 μL移液器吸嘴沿着培养板中央划一横线，加入无血清DMEM培养基，于恒温箱内继续培养过夜，分别在0、24 h时于倒置显微下观察细胞运动情况并拍照记录。计算划痕面积并计算迁移率，公式：细胞迁移率（%）＝［（划痕时面积-24 h后面积）/划痕时面积］×100%。

1.7 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学处理。所有实验数据均以表示，多组资料比较用单因素方差分析，多组资料的组间比较采用最小显著性差异法（least significant difference，LSD）分析。两组资料比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 APN及AMPK抑制剂作用后各组细胞中Bcl-2、MMP-9 mRNA表达及蛋白水平

RTFQ-PCR检测结果显示，APN组中，HEC-1B细胞Bcl-2和MMP-9 mRNA的表达分别为0.64±0.08和0.68±0.02，与对照组（1.00±0.00）相比均明显降低，差异均有统计学意义（P=0.002，P=0.001）；APN+抑制剂组Bcl-2和MMP-9 mRNA的表达分别为0.98±0.11和0.96±0.08，与APN组相比较，均明显升高，差异均有统计学意义（P=0.02，P=0.03，图1A）。

APN组中，HEC-1B细胞Bcl-2和MMP-9蛋白水平分别与对照组、抑制剂组、APN+抑制剂组比较，差异均有统计学意义（P=0.00，图1B）。

图1 APN及AMPK抑制剂作用后HEC-1B细胞中Bcl-2、MMP-9 mRNA及蛋白的表达Fig.1 Expression levels of Bcl-2 and MMP-9 mRNA and proteins in HEC-1B cells after treatment with APN and AMPK inhibitors

2.2 APN及AMPK抑制剂作用于细胞后AMPK、mTOR和4EBP1的活化情况

Western blot检测结果显示，20 μg/mL APN作用HEC-1B细胞30 min后可明显诱导细胞AMPK磷酸化，但抑制mTOR、4EBP1蛋白活化水平（P=0.00），复合物C可明显抑制APN的这种诱导和抑制作用（P=0.05，表1，图2）。

2.3 APN对细胞迁移能力的影响

体外穿膜实验结果显示，APN组穿膜细胞数为（78.72±10.74）个，APN+抑制剂组为（131.45±9.11）个，对照组为（131.91±12.29）个，抑制剂组为（131.56±3.47）个，APN组与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.00），APN+抑制剂组与对照组相比，差异无统计学意义（P=0.12，图3）。

2.4 APN对细胞侵袭能力的影响

细胞划痕实验结果显示，24 h后APN组划痕宽度变化不大，其迁移率为（19.27±1.14）%，较其余3组差异有统计学意义（P=0.00）。对照组（66.51±0.60）%、抑制剂组（70.05±0.10）%、APN+抑制剂组（69.18±0.92）%的划痕宽度在24 h后明显缩窄，3组组间迁移率差异无统计学意义（F=2.787，P=0.39，图4）。

表1 APN及其抑制剂作用后HEC-1B细胞中AMPK、mTOR和4EBP1蛋白活化水平的比较Tab.1 Comparison of activation levels of AMPK,mTOR and 4EBP1 proteins of HEC-1B cells after treatment with APN and its inhibitors()

表1 APN及其抑制剂作用后HEC-1B细胞中AMPK、mTOR和4EBP1蛋白活化水平的比较Tab.1 Comparison of activation levels of AMPK,mTOR and 4EBP1 proteins of HEC-1B cells after treatment with APN and its inhibitors()

*:P＜0.05,compared with another three groups

图2 APN及AMPK抑制剂作用后AMPK、mTOR和4EBP1 Western blot电泳图Fig.2 Electrophoretogram of Western blot of AMPK,mTOR and 4EBP1 after treatment with APN and AMPK inhibitors

图3 体外穿膜实验检测4组HEC-1B细胞的迁移能力Fig.3 HEC-1B cell migration in four groups detected by transwell cell assay

图4 细胞划痕实验检测HEC-1B细胞的侵袭能力Fig.4 Cell scratch test to detect the invasive ability of HEC-1B cells

3 讨论

APN是一种在脂肪组织中特异性表达的激素，其主要是通过与细胞表面的APN受体结合在体内发挥作用［10］。近年来，APN被认为是一种强有力的抑制肿瘤细胞生长的抗癌因子［11］。有研究显示，APN与多种恶性肿瘤关系密切，与其发病率呈反比，包括结直肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、卵巢癌及子宫内膜癌。子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其患病率在中国女性生殖系统恶性肿瘤中已跃居第二位，仅次于宫颈癌。对子宫内膜癌的发病因素及其治疗的研究一直是国内外研究的热点。Yamauchi等［10］研究发现，在高级别子宫内膜癌组织中，APN受体相应的减少，表明APN与子宫内膜癌的发生、发展有关。也有学者［12-13］提出，APN、瘦素等细胞因子可能通过AMPK/mTOR信号通路抑制组织蛋白合成和细胞生长。因此，认为APN可能对子宫内膜癌的发生、发展有抑制作用。

本研究以20 μg/mL APN作用子宫内膜癌HEC-1B细胞30 min后，AMPK蛋白磷酸化水平明显增强，mTOR、4EBP1蛋白磷酸化水平明显降低，而仅以10 μmol/L复合物C作用子宫内膜癌细胞30 min或复合物C预处理细胞30 min后，再加入20 μg/mL APN作用30 min后，AMPK、mTOR和4EBP1蛋白的表达水平则均无明显变化，提示一定浓度APN作用子宫内膜癌细胞一定时间后，可激活AMPK信号通路，激活的AMPK可抑制其下游蛋白mTOR、4EBP1的活化。

本研究发现，APN能抑制HEC-1B细胞的迁移、侵袭，而复合物C可阻断APN的这种抑制作用；在APN处理组中细胞的穿膜数与迁移率明显低于对照组，而复合物C预处理与处理组中细胞的穿膜数与迁移率较对照组则无明显差别。因此，上述结果提示APN在一定浓度、时间下可激活AMPK通路，并抑制HEC-1B细胞迁移、侵袭；表明激活AMPK通路是APN抑制子宫内膜癌发生、发展的重要机制之一，这为延迟或终止子宫内膜癌的进展提供了新方向。

恶性肿瘤的一大重要特征是生长不受限制，这不仅是由肿瘤细胞增殖和分化失控导致的，也与细胞的凋亡及肿瘤细胞的侵袭性有关。Bcl-2是一种较稳定的蛋白，可使多种因素导致的凋亡受到延迟或阻止；MMP-9可以促进分泌明胶酶B，破坏细胞基底膜的完整性，进而发挥促恶性肿瘤细胞生长与远处转移的作用。本研究发现，APN可抑制HEC-1B细胞Bcl-2、MMP-9 mRNA与蛋白的表达，而复合物C亦可阻断APN这种作用，提示APN可通过激活AMPK，下调Bcl-2、MMP-9的表达，从而抑制HEC-1B细胞的侵袭，促进肿瘤细胞凋亡。

综上所述，APN可通过激活AMPK来下调Bcl-2、MMP-9的表达；并可通过刺激AMPK磷酸化，抑制mTOR、4EBP1磷酸化，降低AMPK/mTOR/4EBP1信号转导通路中各通道蛋白的活性，提示在一定时间和浓度作用下，APN可经AMPK/mTOR/4EBP1信号通路发挥作用，这为人们认识脂联素抗子宫内膜癌的机制提供了新的信息。