银参胶囊遗传毒性研究*

刘玉明，蒋定文，李珂娴，陈 伟，侯登勇

（中国人民解放军海军特色医学中心，上海 200433）

银参胶囊具有增强免疫力的作用，以刺五加提取物、银耳提取物等为主要成分。刺五加又名五加参，主治腰膝酸软、体虚乏力，对于提高机体免疫力有重要作用［1］。银耳为祖国医学著名的滋补药，具有滋阴润肺、养胃生津等功效，可提高机体免疫力［2-3］。目前，对刺五加、银耳的毒性报道甚少［4-5］，其遗传毒性研究尚未见报道。本研究中根据《保健食品检验与评价技术规范》，对银参胶囊的遗传毒性进行研究，为其临床应用提供参考，为银参胶囊保健食品申报资料提供试验数据。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 动物、仪器与试药

动物：健康ICR小鼠，体质量25．0～29．8 g，75只（雌性25只，雄性50只）。南京医科大学实验动物中心提供，清洁级，合格证号为SCXK（苏）2008-0004号，SPF级实验动物环境设施合格证号为SYXK（苏）2012-0037。所有动物均给予灭菌鼠饲料和灭菌水，灭菌水自由取用。

仪器：37XB型倒置显微镜（上海光学仪器厂）；XDS-1B型显微镜（重庆光电仪器有限公司）；AL204型电子天平（瑞士Mettler公司）；LD5-2A型离心机（北京医用离心机厂）；DHG-9140A型烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司）；Heracell 150i型CO2培养箱（美国Thermo Electron公司）。

试药：银参胶囊（上海麦迪普生物有限公司，批号为Y12061331）；Ames试验菌株（美国Moltox公司）；琼脂粉、氯化钠、Giemsa染液、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸钠盐、甲醇、伊红染液（中国医药集团上海化学试剂公司）；1，8二羟蒽醌（Macklin公司，批号为C10062078）；叠氮钠（浙江东阳市凯明特种试剂有限公司，批号为200901001）；2-氨基芴（2-AF，J＆K Scientific Ltd．，批号为LP50M40）；环磷酰胺（江苏盛油医药有限公司，批号为12766768）；敌克松（AccuStandard，批号为4030165-01）。

1．2 方法

1．2．1 Ames试验

采用平板掺入法。将银参胶囊设8，40，200，1 000，5 000μg／皿5个浓度，作为剂量组，无菌称取500 mg样品，精密称定，加入灭菌纯净水，定容至10 mL，再用灭菌纯净水连续5倍稀释成所需各浓度。设空白对照组和溶剂对照组各1个，以及阳性对照组4个，其中阳性对照物分别为敌克松（Dexon）50μg（-S9）、叠氮钠（NaN3）为1．5μg（-S9）、2-AF为10μg（＋S9），1，8-二羟基蒽醌为50μg（＋S9）。阳性药分别用蒸馏水和DMSO溶解，加药体积均为0．1 mL。所选菌株为TA97，TA98，TA100，TA102［6-7］，经基因型鉴定，符合要求后将各菌株过夜培养，细菌浓度均在109个／mL或以上。S9肝微粒体酶由Aroclor1254诱导的大鼠肝匀浆，S9混合液中S9浓度为10%。每种菌株每个测试浓度做3皿平行，计数每个试验平皿生长菌落数，试验共测试2次。

1．2．2 小鼠骨髓细胞微核试验

将50只ICR小鼠（雌雄各半）随机分为5组，分别为剂量组3个，空白对照组和阳性对照组各1个，各10只。银参胶囊人体推荐剂量为1．05 g／d，即推荐剂量为17．5 mg／kg BW，3个剂量组分别按人体推荐剂量的143倍、286倍、572倍进行设计，各剂量组配制方法如下。称取银参胶囊粉末2 500，5 000，10 000 mg，精密称定，加纯净水至20 mL配制成受试物，其质量分数依次为低剂量组（2．5 g／kg BW）、中剂量组（5．0 g／kg BW）、高剂量组（10．0 g／kg BW）；阳性对照组取环磷酰胺40 mg加生理盐水至20 mL，配制成质量浓度为2 mg／mL（环磷酰胺40 mg／kg BW），备用；空白对照组给予蒸馏水。各组均采用30 h灌胃法2次，每次灌胃容量为20 mL／kg。第2次灌胃后6 h取股骨骨髓悬于小牛血清中直接涂片、固定、染色，镜检嗜多染红细胞（PCE）1 000个／鼠，计数含微核的细胞数，计算细胞微核率。对每只动物观察并记录200个PCE及所见成熟红细胞（NCE），依此计算PCE／NCE比值［8］。

1．2．3 小鼠睾丸染色体畸变试验

将25只ICR雄性小鼠随机分为5组，剂量组3个、空白对照组和阳性对照组各1个，各5只。3个剂量组配制方法同1．2．2。阳性对照组取环磷酰胺40 mg加生理盐水至10 mL，配制成质量浓度为4 mg／mL，备用；空白对照组给予蒸馏水。各剂量组和空白对照组均连续灌胃5 d，每次灌胃容量均为20 mL／kg，每天1次；阳性对照组腹腔注射（环磷酰胺40 mg／kg BW），连续5 d，每天1次，剂量为10 mg／kg。各组动物均于处死前6 h腹腔注射秋水仙素4 mg／kg，第14天杀鼠取睾丸，拉开曲细精管，低渗、固定、软化、制片、染色、镜检。对每只动物完成500个完整精子的镜检，计算畸形率［9］。

1．3 统计学处理

采用Excel软件建立数据库，SPSS 20．0统计学软件分析。采用χ2检验法和二项分布进行统计与分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 Ames试验

结果见表1。与未处理对照组菌落数相比，阳性对照组有显著差异（P＜0．01），各试验组均未超过2倍以上，样品对标准测试菌TA97，TA98，TA100，TA102均未检出明显的诱变活性，结果为阴性，故认为银参胶囊无致突变性。

2．2 骨髓细胞微核试验

结果见表2。各剂量组的微核率与空白对照组相比，均无显著差异（P＞0．05），也无剂量-反应关系，阳性对照组微核率与空白对照组相比，有显著差异（P＜0．01）；各剂量组PCE／NCE比值均不低于对照组的20%，显示受试物对红细胞无抑制作用。银参胶囊未显示使小鼠骨髓PCE细胞微核率上升的致突变作用，在受试剂量下，未检出银参胶囊样品对雄性小鼠骨髓嗜多染红细胞致微核作用。

2．3 睾丸染色体畸变试验

结果见表3。样品各剂量组小鼠具染色体畸变的初级精母细胞率较空白对照组均无显著差异（P＞0．05），也无剂量-反应关系，阳性对照组较空白对照组有显著差异（P＜0．01）。在受试剂量下，未检出该样品对雄性小鼠睾丸初级精母细胞染色体的诱变活性。

表1 银参胶囊Ames试验结果（±s，n＝3，第1次／第2次）

注：a为Dexon（50μg／皿），b为NaN3（1．5μg／皿），c为2-AF（10．0μg／皿），d为1，8-二羟基蒽醌（50μg／皿）；与溶剂对照组比较，*P＜0．01。

组别剂量（μg／皿）TA97 TA98 TA100 TA102空白对照组溶剂对照组银参胶囊组0 141±15／121±19 0 130±13／144±18 8136±16／153±12 40125±13／168±16 200129±15／162±14 1 000 5 000阳性对照组-S9 132±14／137±15 112±15／113±17 1 232±214c*／1 195±18 5 c*＋S9 127±17／117±14 112±14／122±15 122±16／116±14 121±16／161±15 116±16／140±15 125±13／132±16 106±14／100±16 1 416±190a*／1 3 29±198 a*-S9 31±3／35±5 35±5／42±4 36±3／39±6 34±4／36±4 37±3／35±5 36±4／44±3 33±2／43±3 1 376±153c*／1 230±200c*＋S9 30±2／31±2 32±2／30±2 31±2／30±4 29±3／33±3 32±4／33±4 29±3／34±2 32±3／37±3 1 208±195a*／1 366±211 a*-S9 142±15／129±16 146±18／122±14 178±15／132±16 164±18／139±17 158±17／163±17 186±18／156±15 177±17／165±19 1 185±184c*／1 080±143 c*＋S9 129±16／142±15 122±14／145±16 128±16／124±15 117±16／119±16 120±14／108±15 128±17／128±17 119±15／121±16 1 510±211b*／1 476±165b*-S9 269±26／255±21 262±21／257±21 258±27／252±27 251±23／257±28 272±21／264±21 266±28／251±26 255±33／258±24 835±64 d*／799±129d*＋S9 249±24／250±22 255±20／247±25 251±22／248±23 245±25／252±22 253±20／259±28 248±20／246±22 241±28／255±21 1 214±179a*／1 124±17 4a**

表2 银参胶囊小鼠骨髓细胞微核试验结果（X±s，雌性／雄性，n＝5）

表3 银参胶囊小鼠睾丸染色体试验结果［个（X±s，%），n＝5］

3 讨论

遗传毒性研究是药物安全性评价的重要内容，是药物进入临床试验及上市的重要环节，遗传毒性研究在很大程度上将影响到药物开发的进程［10］。

Ames试验为体外试验，是当前所有遗传毒性评价方法中对致癌物预测度最高的试验，其遗传学终点是基因突变，是通过能否引起鼠伤寒沙门菌基因组碱基置换或移码型突变来评价药物的，是化合物定量构效关系（QSAR）建立的遗传毒性筛选数据库的重要基础［11］。本研究结果显示，银参胶囊对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型4个菌株TA97，TA98，TA100，TA102均无致突变作用。小鼠骨髓PCE微核试验是用来评价外源性因素对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤的一个直观、有效、可行的方法［12］。由于其能简便、快速、准确地检测出断裂剂和非整倍体诱导剂，故广泛应用于化合物遗传毒性筛选及评价［13-14］。银参胶囊的微核试验中，未发现其对小鼠骨髓PCE的微核率有明显影响，可认为该试验为阴性。小鼠睾丸细胞染色体畸变试验广泛应用于评价食品、药品等对雄性小鼠生殖功能产生的影响，其机制主要是观察睾丸细胞染色体的形态改变［15］。试验中亦未发现银参胶囊对小鼠睾丸染色体畸形发生率有明显影响。

综上所述，银参胶囊3项遗传毒性试验结果均为阴性，判定其遗传毒性安全。今后应开展多项研究，为开发更多新的功能提供科学依据，也为长期作业在特殊环境中的广大官兵健康维护提供新的产品。

致谢：特别感谢江苏省疾控中心毒理与功能评价实验室的各位老师对本研究中试验方案给予的指导及在试验操作中所付出的努力。