多囊卵巢综合征病人卵泡液褪黑素与氧化应激的关联研究

王丽佳

作者单位：无锡市妇幼保健院妇产科，江苏 无锡 214002

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种内分泌疾病，在生育期女性中较为常见。PCOS 病人卵泡液内有氧化应激状态的异常，PCOS 的发病与活性氧的代谢失衡有关，抗氧化剂能改善PCOS的预后［1-4］。褪黑素是松果体分泌的神经内分泌激素，其抗氧化活性很强［5-6］。近年的研究发现褪黑素具有抗氧化活性，能有效地清除自由基、调节抗氧化酶活性，具有极强的给电子活性和下调氧化应激水平的作用［7-9］。本研究通过测定PCOS 病人卵泡液中总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）以及褪黑素、丙二醛（malondialdehyde，MDA）表达，旨在探讨PCOS 病人卵母细胞质量降低的因素与机制，为改善辅助生殖技术治疗提供科学根据。

1 资料与方法

1.1 一般资料按照纳入和排除标准选取2016年1 月至2017年12 月无锡市妇幼保健院收治的不孕病人50 例，其中观察组30 例为PCOS，对照组20 例为输卵管因素导致的不孕病人。观察组入组标准：①稀少排卵或没有排卵；②有高雄激素血症或者高雄激素的特点；③超声检查发现双侧卵巢都有≥12个直径2～9 mm 的窦卵泡；④临床资料完整者。对照组入组标准：①输卵管因素导致的不孕病人；②基础激素水平正常、月经规律；③有＞5个双侧窦卵泡；④近半年没有使用过甾体激素类药物；⑤病人注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）当日有5个以上直径≥14 mm的卵泡；⑥临床资料完整者。病人排除标准：①最近进行过任何维生素类等抗氧化药物治疗的病人；②染色体异常、有子宫内膜病变；③排除有精神疾病及性传播病史；④由于男方原因不孕的病人；⑤子宫内膜异位症、子宫畸形、卵巢囊肿、卵巢肿瘤。病人或其近亲属对本研究知情同意，签署了知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性卵巢刺激 观察组中月经不规律病人应用一次黄体酮撤退性出血，于月经第3 天实施醋酸环丙孕酮治疗。重组人促卵泡激素或者人绝经期促性腺激素，进行控制性刺激卵巢。控制性卵巢刺激的方案：促性腺激素释放激素激动剂（GnRHA）方案（拮抗剂方案），Gn 启动剂量100～200 IU/d。监测过程以调节Gn为主，逐渐增量，一次增量37.5～75.0 IU，应用GnRH-A+HCH降量双扳机防止卵巢过度刺激综合征。对照组处理方案：亦采用GnRH-A方案（拮抗剂方案）。采用经阴道B超测定病人卵泡以及子宫内膜的生长情况。当出现2 个直径≥18 mm的卵泡时，应立即停止促性腺素的使用，并对促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、睾酮（T）水平进行抽血检测，当天进行注射HCG，在HCG 注射后的34～36 h进行取卵。

1.2.2 体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）取卵后，在卵泡液中取出卵-冠-丘复合物，通过卵母细胞成熟度分型与精卵进行培养，在受精后的12～14 h 对受精状况进行检测，进行1 d受精后，对受精卵的卵裂状况进行评估，在受精后第3 天，将胚胎放置到宫腔内。之后进行黄体酮注射60 mg/d，第14～16 天后进行尿妊娠试验或者对血清β-HCG进行检测，测定为阴性的病人停止使用黄体酮，测定为阳性的病人进行黄体酮的继续使用，移植1 个月后采用经阴道超声检测妊娠结果，注射黄体酮直至移植后10～12周。

1.2.3 精子卵浆内注射技术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）采卵后，将卵-冠-丘复合物从卵泡液中取出，并于在采卵后4 h以去颗粒细胞的方式处理卵母细胞，卵胞质内ICSI 注射单个精子，16～18 h后，对受精情况进行检测，受精后1～2 d 内对卵裂情况进行评估，在受精3 d 后，将胚胎放置到宫腔内。其他步骤与IVF-ET一致。

1.2.4 卵泡液收集 取卵日采用阴道超声对卵泡进行穿刺，收集卵泡液，进行离心，将上清液收集在离心管中。按照可见分光度法对总TAC进行测定，按照硫代巴比妥酸法对MDA进行测定，按照酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法对褪黑素水平进行测定；分别采用葡萄糖氧化电极法、放射免疫法测定病人空腹血糖（FSG）以及空腹胰岛素（FINS）水平，并计算胰岛素敏感指数（ISI），ISI＝1/（FSG×FINS）。全部操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法本研究中数据全部采用SPSS20.0 统计分析软件（美国IBM 公司）进行处理。计量资料采用表示，组间比较采用独立样本t检验。计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2分析。P＜0.05 代表差异有统计学意义。

表1 不孕病人50例观察组和对照组基本资料比较

2 结果

2.1 两组病人基本资料比较调查结果显示，两组病人年龄、体质量（BMI）指数、不孕年限、不孕类型以及受精方式均差异无统计学意义（P＞0.05），故可排除上述因素对研究结果造成的影响，数据具有可比性，见表1。

2.2 两组病人基础激素水平比较观察组病人LH、T水平高于对照组，FSH、E2水平低于对照组，两组间基础激素水平差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不孕病人50例观察组和对照组基础激素水平比较/

表2 不孕病人50例观察组和对照组基础激素水平比较/

注：LH 为促黄体生成素，T 为睾酮，FSH 为血清卵泡刺激素，E2为雌二醇

2.3 两组病人胰岛素水平比较观察组病人FINS水平高于对照组、ISI 高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组病人FSG水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 不孕病人50例两组空腹血糖和空腹胰岛素水平比较/

表3 不孕病人50例两组空腹血糖和空腹胰岛素水平比较/

注：FSG为空腹血糖，FINS为空腹胰岛素

2.4 两组病人褪黑素水平比较观察组病人褪黑素水平（120.71±9.32）pg/mL 低于对照组（138.39±11.03）pg/mL，差异有统计学意义（t＝6.105，P＜0.05）。

2.5 两组病人卵泡液中氧化/抗氧化能力指标比较观察组病人TAC水平低于对照组，观察组病人MDA 水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 不孕病人50例观察组和对照组卵泡液中氧化/抗氧化能力指标比较/（pg/mL，）

注：TAC为总抗氧化能力，MDA为丙二醛

2.6 卵泡液褪黑素与氧化应激指标间的相关性分析相关性分析结果显示，卵泡液褪黑素水平与TAC水平呈正相关（r＝0.705，P＜0.05），未发现卵泡液褪黑素水平与MDA 水平之间的相关性（r＝-0.110，P＞0.05）。

3 讨论

目前有关PCOS的具体产生机制还没有完全明确。大量研究证实，PCOS 卵母细胞质量降低很大程度上与氧化应激相关，推测PCOS 的产生因素之一是由于氧化应激，引发卵母细胞质量变差的主要因素或许是氧化损伤［10-12］。病人卵泡液中氧化应激水平升高，且与卵母细胞中纺锤体缺失比例增多有关，致使其受精率、优胚率及临床妊娠率降低，推测过氧化损伤可能是卵母细胞质量下降的原因之一［13-14］。褪黑素属于吲哚类的神经内分泌激素之一，其分布范围较广，在多种生物体内均可发现。研究表明，褪黑素的分泌会受到多种外界因素的影响（光照等），能够根据外界环境发生的变化而对机体产生适应性生理的过程进行调控，在生物的生长、发育、繁殖过程中均扮演重要角色［15-17］。较早研究结果指出，褪黑素的主要功能为调控体内昼夜节律，随着科技的发展与研究的不断深入，研究人员发现褪黑素属于强效的内源性抗氧化剂之一，能够调节机体的卵泡发育、性发育且在维持妊娠方面具有十分重要的作用。临床研究证实，褪黑素在卵泡液中的表达较高。近年来，有学者提出卵泡液中的褪黑素能够保护卵母细胞使其免受氧化应激损伤。

多囊卵巢综合征属于一类多见的生育年龄妇女的内分泌和代谢异常所出现的疾病，卵泡液成分以及水平的改变对妇女生殖功能有十分关键的作用［18-20］。研究人员以SD大鼠为研究对象，发现采取摘除松果体或长时间的光照等方式能够对褪黑素的分泌起到抑制作用，导致大鼠出现PCOS 的症状以及病理改变。目前针对PCOS病人卵泡液中褪黑素浓度是否有变化在国内外的研究中均较为少见，因此，本研究对PCOS 病人卵泡液中褪黑素水平与氧化应激指标的相关性进行分析，探讨其是否参与了PCOS 卵母细胞质量下降。研究表明，观察组病人卵泡液中褪黑素表达降低、TAC 表达下降、MDA表达上升；而且，病人卵泡液中褪黑素表达与TAC呈正相关关系。该结果说明在PCOS病人的卵泡液褪黑素与TAC呈正相关，提示褪黑素可能为卵泡液中重要的抗氧化剂，具有保护卵母细胞使其避免受氧化应激损害的作用，在卵泡发展过程中扮演重要角色［21，22］。此外，研究发现，PCOS 病人可能有卵母细胞质量下降，且该类病人卵泡液中MET 水平降低，卵泡液中MET 水平与TAC 成正相关，即MET 可能参与了PCOS 病人卵母细胞过氧化损伤，这些研究结果与本研究可以相互印证。

多囊卵巢综合征病人的卵母细胞由于其受到氧化应激损害，并引发卵母细胞质量变差，从而对治疗效果产生严重影响，推测可能与卵泡液中褪黑素水平的降低具有一定的关系，这为PCOS 的发病因素的研究及诊治提供了科学的依据。因此对褪黑素在PCOS发病中的具体机制进行进一步的研究探索，为提升PCOS病人的诊治提供新的治疗思路。