急性心肌梗死病人血浆中微小RNA-21 定量检测及其临床意义

董松武，张静

作者单位：亳州市人民医院，a心血管内科，b检验科，安徽 亳州 236800

心血管疾病的发病率和病死率逐年上升，严重危害人类的生命健康。急性心肌梗死（acute myocardial infraction，AMI）是由于血栓或冠状动脉粥样硬化斑块的急性改变引发冠状血流供应严重受损，导致心肌的缺血损伤。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类新发现的长度约为22 个核苷酸的以序列特异性方式转录后调控基因表达的非编码单链RNA分子［1］，在生物体的生长、发育、分化和凋亡等方面起着重要调控作用。近年来研究表明miRNA在心脏重塑、血管细胞收缩、心肌收缩以及脂质代谢等心血管疾病中发挥重要的调控作用［2-3］。miR-21 是一种位于17q23.2 染色体FRA17B脆性区域具有自主转录单位的miRNA［4］，其在新生内膜细胞中表达上调，是血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和凋亡的重要调节者［5］，miR-21 在多种肿瘤细胞中表达也出现显著异常。本研究采用特异的茎环引物逆转录和real-time PCR 检测AMI 病人和健康对照者外周血血浆中miR-21 的表达量，分析和探讨其在AMI 发生发展过程中的作用和诊疗中的临床应用价值，采用ROC 曲线评价miRNA-21、肌钙蛋白在AMI 病人中的诊断效率，采用Pearson 相关性分析AMI 病人血浆中miR-21 表达和肌钙蛋白的相关性，为临床提供新的诊断视角和指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016年8 月至2017年8 月亳州市人民医院住院AMI病人40例，其中男22例，女18例，年龄范围为36～61岁，年龄（45.1±11.2）岁，同期本院体检健康者作为健康对照40 例，其中男20例，女20 例，年龄范围为28～58 岁，年龄（42.8±10.5）岁，两组研究对象年龄、性别比例相匹配。病人或其近亲属知情同意。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

AMI 的入选标准：参照2012年［6］欧洲颁布全球心肌梗死定义：心脏标志物水平超过正常参考值上限，同时伴有下述心肌缺血证据之一：心肌缺血症状；ECG 提示新发缺血性改变（新发ST-T 改变或新发左束支传导阻滞）；ECG 提示新发病理性Q 波形成；影像学证据提示新发局部室壁运动异常或存活心肌丢失；冠脉造影或尸检发现冠脉内存在新鲜血栓。排除标准：合并有瓣膜性心脏病、急慢性感染性疾病、血液系统疾病、肿瘤、周围血管性疾病、严重肝肾功能不全、糖尿病、全身免疫性疾病、慢性阻塞性肺疾病、心律失常等疾病。

1.2 主要试剂和仪器miRCute miRNA 提取分离试剂盒（天根，离心柱型，生产批号O4208），RealMasterMix Probe 试剂盒（天根，生产批号O4215），5×Reverse Tanscriptase M-MLV buffer（大连宝生物，生产批号AHG0090A），dNTP Mixture（10 mmol/L）（大连宝生物，生产批号AI21491A），Reverse Transcriptase M-MLV（200 U/μL，大连宝生物，生产批号BL1501D），20×RNAsafe（天根，生产批号n3205），Rnase Free ddH20（天根，生产批号O4214），Gene Amp PCR System 9700扩增仪（ABI），Light Cycler real time PCR扩增仪（Roche）。

1.3 引物和探针由上海闪晶生物工程有限公司设计合成，见表1。

1.4 血浆总RNA 提取采集研究对象外周血浆1 mL，用天根miRCute miRNA提取分离试剂盒按试剂说明书提取miRNA，用紫外分光光度仪检测总RNA溶液吸光度（A）值，A260/A280 比值在1.9～2.1 者于-80℃保存备用于后续实验。

1.5 试验方法

1.5.1 逆转录反应 反应体系及循环条件：5×Reverse Tanscriptase M-MLV buffer 8 μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）各2 μL，RT 引物（5 pmol/μL）2 μL，Reverse Transcriptase M-MLV（200 u/μL）1μL，20×RNAsafe 2 μL，Total RNA 4 μL，Rnase Free ddH 20 15 μL，混匀后于PCR 仪上16 ℃30 min，42 ℃40 min，85 ℃5 min，扩增产物-20 ℃冰箱保存备用。

1.5.2 荧光定量PCR 反应体系及循环条件：2.5×realMasterMix 8 μL，正、反向引物（5 pmol/μL）各1 μL，20×Probe Ehancer solution 1 μL，探针（5 pmol/μL）1 μL，模板1 μL，ddH20 7 μL，混匀后于PCR 仪上94 ℃预变性2 min，94 ℃20 s，60 ℃30 s，68 ℃1 min，共43个循环。

1.6 统计学方法每个反应均设3个复孔，反应管中荧光信号达到设定阈值时的循环数为Ct值，以小核RNA U6作内参，采用2-△△Ct相对定量法分析AMI病人血浆中miR-21 基因表达相对于健康对照血浆中基因表达的变化倍数F（2-△△Ct），△△Ct＝AMI（CtmiR21-CtU6）-NC（CtmiR21-CtU6）。F（NC）＝1（△△Ct＝0）。

采用SPSS 17.0软件。KS检验作数据正态分布分析，数据符合正态分布，采用两独立样本t检验；评价诊断效率采用ROC曲线分析，Pearson相关性分析miR-21 和肌钙蛋白浓度的相关性，P＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 miR-21 qRT-PCR引物及探针序列

2 结果

2.1 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增片段经20%聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见清晰、明亮的电泳条带，与理论大小一致（56 pb），见图1。

图1 miR-21和U6扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图

2.2 建立标准曲线将U6反转录产物和miR-21反转录产物倍比稀释后，行PCR 扩增建立标准曲线。扩增效率分别为94.98%，92.71%，两组扩增效率接近，故可以使用2-△△Ct相对定量法进行分析，见图2和图3。

图2 miR-21和U6的标准曲线：A为miR-21；B为U6

2.3 miR-21的荧光定量PCR扩增曲线见图3。

图3 心肌梗死组和健康对照组miR-21的扩增曲线：A1-A4 为心肌梗死组，B1-B7为健康对照组

2.4 miR-21 在心肌梗死和健康对照血浆中的表达以U6 为内参，用real-time PCR 分析miR-21 的表达。结果显示miR-21 在心肌梗死组中的相对表达量均值（2-△△Ct）为2.51，与健康对照组的表达量比较，差异有统计学意义（t＝10.20，P＜0.05），见图4。

2.5 miRNA-21、肌钙蛋白对AMI病人的诊断效能分析（ROC分析）在急性心肌梗死病人miR-21的AUC 为0.88，肌钙蛋白的AUC 为0.98，与肌钙蛋白的诊断效率接近，相关性分析表明，miR-21 水平和肌钙蛋白浓度成正相关，相关系数为0.48（P＜0.05），miR-21和肌钙蛋白在心肌梗死及健康对照组血浆中的ROC曲线分析见图5和图6。

图4 miR-21在心肌梗死及健康对照组血浆中的表达

图5 miR-21在心肌梗死及健康对照组血浆中的ROC曲线分析

图6 肌钙蛋白在心肌梗死及健康对照组血浆中的ROC曲线分析

3 讨论

近年来，随着冠心病的发病率和死亡率的日趋升高，miRNA 介导心脏发育、心肌肥厚、心率失常及心衰等多种心血管疾病病理生理调控机制的研究已成为当前研究的热点，多项研究表明，可在人体多种体液包括血清、血浆、尿液、唾液中检测到异常表达的循环miRNA，有研究人员提出特定的miRNA 有望成为心肌梗死及其他疾病的标志物［7-8］。Van Roojj 等［9］研究发现在大鼠和人类心肌梗死后可检测到miR-21、miR-214、miR-223 表达上调，同时miR-149及miR-29家族表达下调。Dong［10］通过结扎大鼠左冠状动脉建立心肌梗死模型，6 h后检测心肌细胞miRNA 表达情况，发现miR-21 在梗死区表达降低，而在临界区表达明显升高。Dong 近一步通过腺病毒载体于急性心肌梗死3 天前转染miR-21 到大鼠心肌细胞，发现相对于单纯急性心肌梗死组24 h 的心肌梗死面积减少29%。表明miR-21 在急性心肌梗死早期保护缺血心肌细胞损伤方面起到关键作用，其机制可能与调控程序性细胞死亡分子（PDCD）-4 及激活蛋白（AP-1）有关，体内试验研究证实miR-21 过表达可明显减低心肌细胞凋亡率。

本研究采用2-△△Ct相对定量法分析40 例AMI病人血浆中miR-21相对于40例健康对照血浆中表达量，结果表明实验组血浆miR-21 表达水平明显增高，与健康对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），AMI 病人血浆中miR-21 与肌钙蛋白成正相关（r＝0.48，P＜0.05），其AUC 为0.88，与杨寿娟等［11］研究结果一致，认为miR-21 是潜在的诊断学标志物，对缺血灌注损伤的心肌具有保护作用。心肌梗死病人miR-21 表达增高可能是机体的保护机制，同时为miR-21 成为药物治疗靶点对缺血心肌进行临床治疗提供了一个新的思路。Roy 等［12］在心肌缺血/再灌注的模型中，发现miR-21 作用于PTEN，引起基质金属蛋白酶2 的增加，参与心肌梗死后心肌肥厚、心肌纤维化进程；miR-21 与miR-26能用过PTEN/AKT 信号通路从而抑制缺氧诱导的细胞凋亡，有望成为改善AMI后心肌重构的潜在靶点［13-14］；马超［15］等通过观察低能激光照射（LLLI）对大鼠心肌梗死模型梗死区及其边缘组织中miR-21表达的影响，发现LLLI 处理梗死心肌能有效上调梗死及边缘区域miR-21 的表达，miR-21 有较好的心肌保护作用。多项实验证实了miR-21 参与了心肌梗死后的心脏重塑过程。目前所有的探索miRNAs 对AMI 模型都是通过动物实现的，尚未有人体试验的研究报道，有待研究人员深入探讨。同时miR-21 不是一个高度特异性的检测指标，有研究表明miRNA 对食管癌［16］的诊断有一定价值，在HCC 病人［17］、乳腺癌［18］病人、慢性心力衰竭［19］、胃癌［20］病人血清中表达水平均增高。不同的miRNA分子也可在心肌梗死病人血清中同时表达异常，肖蕾等人［21］通过meta 分析表明miRNA-499 在早期急性心肌梗死病人血清中升高，可作为早期诊断的分子生物学标志。

综合本研究的试验结果，虽然目前对miRNA的研究已经取得了一些成果，但仍有很多问题需要进一步深入探究和进行临床验证，miRNA在不同疾病有特定的表达谱，我们应寻求针对不同疾病的特定的表达谱提高诊断的敏感性和特异性，miRNA距离临床应用还有很多未解决的问题，亟需广大研究人员深入探索。