隐丹参酮通过G 蛋白偶联受体55 调节Wnt/β-catenin 信号通路抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡及其作用机制研究

方松城，林钊宇，叶志佳，刘志国

作者单位：1东莞东华医院口腔科，广东 东莞 523110；2中山大学附属孙逸仙纪念医院口腔颌面头颈外科，广东 广州 510000；3中山大学附属口腔医院口腔颌面外科，广东 广州 510000

舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤，也是最常见的口腔鳞状细胞癌之一，其恶性程度高，预后差［1］。传统放化疗常因肿瘤细胞耐药或毒副作用大而导致治疗效果差，研究和开发新的抗癌药物，有效治疗舌鳞癌是临床研究的一个重点，中药是我国传统医药，近年来在抗肿瘤方面具有独特作用［2］。隐丹参酮（Cryptotanshinone，CT）是从传统中药丹参中提取出的有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化等活性，对肿瘤细胞有毒副作用，不仅能阻碍肿瘤细胞增殖，而且可以诱导肿瘤细胞分化和促进肿瘤细胞程序性死亡，从而在一定的程度上阻碍肿瘤细胞侵袭和防止其向远处转移［3］。有报道发现隐丹参酮可抑制三阴乳腺癌MDA-MB-231 细胞活性、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡［4-5］。隐丹参酮还能诱导人肝癌细胞HepG-2 细胞凋亡［6］；此外，隐丹参酮可以抑制舌鳞癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力，促进细胞凋亡［7］。G 蛋白偶联受体55（G protein-couple receptor 55，GPR55）在信号转导和生理代谢过程中具有重要作用，有研究表明GPR55 在鳞癌中过量表达，能增强鳞状细胞癌的生长、侵袭、迁移等能力［8］。GPR55在喉鳞癌组织中高表达，并且与分化程度和颈淋巴结转移率有关，沉默GPR55 明显抑制Hep-2 细胞的侵袭和转移能力［9］。GPR55 还能促进结直肠癌进展［10］。Wnt/β-catenin 信号通路是细胞中的一个重要信号通路，在细胞的分化、增殖和凋亡以及细胞癌变、肿瘤侵袭等病理过程中均发挥重要的调控作用［11］。本文自2017年1月至2018年1月研究隐丹参酮对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制是否与GPR55和Wnt/β-catenin信号通路相关。

1 材料与方法

1.1 材料舌鳞癌细胞SCC4购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶购自美国Gibico 公司；LipofectamineTM2000 购自Sigma 公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；MTT试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙锭（PI）试剂盒、BCA 试剂盒、RIPA 蛋白裂解液、SDS-PAGE 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；pcDNA-GPR55、si-GPR55载体质粒均购自金瑞斯生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 舌鳞癌细胞SCC4用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基于37 ℃、5%二氧化碳饱和湿度条件下培养，2～3 d换液一次，待细胞融和至80%左右时，加入胰蛋白酶进行消化传代，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 药物处理与分组 当细胞融和至80%左右时，将细胞传代接种至96 孔板中，用不同浓度的隐丹参酮（0、2、4、8、16、32 μmol/L）处理舌鳞癌细胞，分别记为0 CT 组、2 CT 组、4 CT 组、8 CT 组、16 CT组、32 CT 组；将pcDNA-con，pcDNA-GPR55、分别转染至未经任何处理的舌鳞癌细胞中，记为pcDNAcon组，pcDNA-GPR55组；将si-con、si-GPR55转染至舌鳞癌细胞后用8 μmol/L 的隐丹参酮处理，分别记为CT+si-con 组、CT+si-GPR55 组，以未经任何处理的细胞作为空白对照（NC），转染均按照LipofectamineTM2000转染试剂盒操作。

1.2.3 MTT检测细胞增殖抑制率 在各组细胞培养至48 h时加入20 μL（5 g/L）的MTT溶液，继续孵育4 h；弃去多余培养基并加入150 μL DMSO 振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处吸光度（OD）值。细胞增殖抑制率（%）＝1-实验组OD 值/空白对照组OD 值×100%。每组重复3次，每次设3个复孔，即样本数n＝9。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各组细胞，离心收集细胞，PBS 漂洗2 次，加结合缓冲液重悬细胞。依据试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC 和PI 避光孵育。流式细胞仪检测激发波长488 nm 和发射波长530 nm 处的荧光强度。实验重复3次。

1.2.5 qRT-PCR 检 测GPR55 mRNA的表达水平收集0 CT组、4 CT组、8 CT组细胞，研磨充分后加入Trizol 试剂提取总RNA，微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。使用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，按照TaKaRa 荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，以β-actin 为内参进行PCR 扩增，每个样品重复3次，循环条件为95 ℃30 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，共40个循环；60 ℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.6 蛋白质印迹法检测蛋白表达 收集各组细胞，加入RIPA 裂解液裂解，4 ℃，12 000g离心15 min，收集蛋白上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳后转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜；加入二抗（1∶2 000）室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，后在暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白表达水平。每个蛋白样品重复3次。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.00 进行统计学分析。计量资料以表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的CT 对TSCC 细胞增殖的影响MTT 法检测显示，0 CT组、2 CT组、4 CT组、8 CT组、16 CT 组、32 CT 组细胞增殖抑制率分别为（0.00±0.02）%、（25.04±2.50）%、（68.56±5.86）%、（85.44±8.54）%、（88.25±8.82）%、（80.11±8.01）%，与不含隐丹参酮的细胞相比，不同浓度隐丹参酮处理组TSCC细胞的增殖抑制率均显著升高（F＝284.028，P＜0.05）。可见，隐丹参酮抑制TSCC细胞的增殖。

2.2 不同浓度CT对TSCC细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果（表1，图1A）显示，与隐丹参酮浓度为0 的组相比，浓度为4 μmol/L 和8 μmol/L 的隐丹参酮组TSCC 细胞的凋亡率均显著升高（P＜0.05）。蛋白质印迹法检测结果（表2，图1B）显示，与隐丹参酮浓度为0 的组相比，浓度为4 μmol/L 和8 μmol/L的隐丹参酮组TSCC 细胞中Bax 的表达水平显著升高，Bcl-2的表达水平显著降低（P＜0.05）。可见，隐丹参酮促进TSCC细胞凋亡。

图1 隐丹参酮对TSCC细胞凋亡的影响：A为流式细胞仪检测细胞凋亡；B为蛋白质印迹法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达

表1 不同浓度隐丹参酮（CT）对TSCC细胞凋亡的影响/

表1 不同浓度隐丹参酮（CT）对TSCC细胞凋亡的影响/

注：与0 CT组比较，aP＜0.05

2.3 不同浓度CT 对GPR55 表达的影响qRTPCR 和蛋白质印迹法检测结果（图2，表2）显示，与隐丹参酮浓度为0 的组相比，隐丹参酮浓度为4 μmol/L 和8 μmol/L 的隐丹参酮组TSCC细胞中GPR55 mRNA 和蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）。可见，隐丹参酮促进GPR55的表达。

图2 蛋白质印迹法检测不同浓度隐丹参酮（CT）处理TSCC细胞后GPR55蛋白表达

表2 不同浓度隐丹参酮（CT）对GPR55表达的影响/

表2 不同浓度隐丹参酮（CT）对GPR55表达的影响/

注：与0 CT组比较，aP＜0.05

2.4 高表达GPR55抑制TSCC细胞增殖和凋亡影响的研究MTT法检测结果（表4）显示，与pcDNA-con组相比，pcDNA-GPR55组TSCC细胞增殖抑制率显著升高（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果（表4）显示，与pcDNA-con组相比，pcDNA-GPR55组TSCC细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。蛋白质印迹法检测结果（图3，表3）显示，与pcDNA-con组相比，pcDNA-GPR55组TSCC细胞中CyclinD1、Bcl-2表达水平显著降低，Bax、GPR55表达水平显著升高（P＜0.05）。可见，高表达GPR55抑制TSCC细胞增殖、促进凋亡。

图3 蛋白质印迹法检测GPR55、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表达

2.5 低表达GPR55 可以逆转CT 对TSCC 细胞增殖和凋亡的影响MTT 法检测结果（表4）显示，与NC 组相比，CT 组TSCC 细胞增殖抑制率显著升高；与CT+si-con 组相比，CT+si-GPR55 组TSCC 细胞增殖抑制率显著降低（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果（表4）显示，与NC 组相比，CT 组TSCC 细胞凋亡率显著升高；与CT+si-con 组相比，CT+si-GPR55 组TSCC 细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。蛋白质印迹法检测结果（图4，表4）显示，与NC 组相比，CT组TSCC 细胞中CyclinD1、Bcl-2 表达水平显著降低，Bax 表达水平显著升高；与CT+si-con 组相比，CT+si-GPR55组TSCC细胞中CyclinD1、Bcl-2表达水平显著升高，Bax、GPR55 表达水平显著降低（P＜0.05）。可见，低表达GPR55可以逆转CT对TSCC细胞增殖抑制和凋亡促进的作用。

图4 蛋白质印迹法检测GPR55、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表达

2.6 蛋白质印迹法检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达蛋白质印迹法检测β-catenin 蛋白表达结果（图5）显示，与NC 组（0.75±0.08）相比，CT组TSCC细胞中β-catenin表达水平（0.26±0.03）显著降低；与CT+si-con 组（0.30±0.03）相比，CT+si-GPR55 组TSCC 细胞中β-catenin 表达水平（0.62±0.06）显著升高（F＝176.212，P＜0.05）。

图5 蛋白质印迹法检测β-catenin蛋白表达

3 讨论

舌鳞状细胞癌具有易早期转移和局部复发的特点，死亡率高，严重影响患者预后，开发疗效更好的肿瘤药物以有效防止疾病复发，最终提高患者生存率是亟需的［12］。近年来研究发现，隐丹参酮具有显著的抗肿瘤效果，可诱导细胞凋亡［13］。研究发现隐丹参酮通过抑制STAT3 的磷酸化而抑制舌鳞癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力，同时促进细胞凋亡［7］；隐丹参酮还能抑制人肺腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡［14］。以上研究均表明隐丹参酮具有抗肿瘤作用。本实验结果显示，不同浓度的隐丹参酮处理后，舌鳞状癌细胞中细胞增殖抑制率和细胞凋亡率显著升高，Bcl-2表达水平显著降低，Bax表达水平显著升高。Bcl-2和Bax是调控细胞凋亡的关键因子，Bax是促凋亡因子，Bcl-2是抑凋亡因子，Bax高表达和Bcl-2低表达水促进细胞凋亡［15］。表明隐丹参酮可抑制舌鳞状癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。

据报道G蛋白偶联受体（G protein-couple receptor，GPCR）与肿瘤的增殖、侵袭和转移等多种恶性（bleeding on probing，BOP）阳性（+），X 线牙片显示生物学行为密切相关［16］。GPR55是GPCR家族成员之一，研究发现GPR55减少了体内外胰腺癌细胞的生长［17］。敲低GPR55 促进了结肠癌细胞的迁移和黏附［18］；lncRNA H19 通过调控GPR55 抑制舌鳞癌增殖、迁移与侵袭［19］。以上研究结果表明GPR55在肿瘤中可能是一个抑癌因子，本实验结果显示，过表达GPR55，细胞增殖抑制率和细胞凋亡率显著升高，CyclinD1、Bcl-2 表达水平显著降低，Bax 表达水平显著升高。CyclinD1 是调控细胞周期的关键因子，其高表达会引起细胞过度增殖而导致癌变，低表达可控制癌细胞增殖［20］。说明过表达GPR55 可抑制舌鳞状癌细胞增殖，促进细胞凋亡。且本实验还发现隐丹参酮处理后GPR55表达水平升高，而低表达GPR55 逆转了隐丹参酮对舌鳞状癌细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。说明，隐丹参酮可能通过调控GPR55表达影响舌鳞状癌细胞的增殖和凋亡。

表3 高表达GPR55抑制TSCC细胞增殖和凋亡影响的研究/

表3 高表达GPR55抑制TSCC细胞增殖和凋亡影响的研究/

注：与pcDNA-con组比较，aP＜0.05

表4 低表达GPR55可以逆转CT对TSCC细胞增殖和凋亡的影响/

表4 低表达GPR55可以逆转CT对TSCC细胞增殖和凋亡的影响/

注：与NC组比较，aP＜0.05；与CT+si-con组比较，bP＜0.05

Wnt/β-catenin信号通路在舌鳞状细胞癌的发生发展中具有重要的作用，β-catenin 表达下调显著抑制舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡［21］。沉默β-catenin 抑制皮肤鳞状细胞癌细胞SCC12增殖［22］。而激活Wnt/β-catenin通路可促进食管鳞癌细胞上皮间质转化及转移［23］。在本实验中，隐丹参酮处理舌鳞状细胞癌细胞后Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的表达显著降低，且隐丹参酮抑制了舌鳞状癌细胞增殖，促进细胞凋亡。说明隐丹参酮可能通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路而抑制舌鳞状癌细胞增殖，促进细胞凋亡。此外，低表达GPR55 逆转了隐丹参酮对β-catenin 表达的抑制作用。提示，隐丹参酮可能通过GPR55调控Wnt/βcatenin信号通路进而影响舌鳞状细胞癌进展。

综上所述，隐丹参酮可抑制舌鳞状癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，其机制可能与调控GPR55 及Wnt/β-catenin信号通路有关。将可为舌鳞状细胞癌的治疗提供新思路和新靶点。