不同剂量γ 射线照射对肺癌细胞分化、增殖、凋亡以及放疗敏感性的影响

饶石磊，杨峥，王旸，齐书然，张凯

作者单位：南阳市中心医院放疗科，河南 南阳 473000

肺癌在全球是普遍高发的恶性肿瘤，大约31%与癌症相关的死亡是由肺癌造成的［1］。近年来，随着经济的发展，我国已成为肺癌发病率增长最快的国家之一，且发病年龄也呈年轻化趋势［2］。大多数肺癌患者就诊时已到肿瘤中晚期，已不能进行手术，因此放疗就成为常用的主要治疗手段［3］。放疗是利用放射线杀伤肿瘤的一种局部治疗方法［4］，临床上最常用的放射线是x 线、γ 射线及β 射线［5］，用不同剂量的γ射线照射肺癌细胞株A549、H460以及H1299，可促进细胞增殖，抑制其凋亡［6］。但放疗会使肿瘤细胞产生耐受性，降低放疗敏感性，多种因素都可影响放疗敏感性，如放疗剂量、药物、基因表达等［7］，照射前使用吉非替尼能增强x 线照射对肺腺癌细胞H358 的放射敏感性［8］。癌细胞具有分化障碍的特性，诱导癌细胞向正常细胞或近似正常细胞分化可降低癌细胞恶性程度，更有利于肿瘤的治疗［9］，维甲酸（retinoic acid，RA）可诱导肿瘤细胞向成熟分化，恢复细胞正常或接近正常的表型和功能，进而抑制其增殖，诱导其凋亡［10］，但不同剂量照射对肺癌细胞分化的影响目前并不明确。本研究自2018年3月至2019年3月通过使用不同剂量的γ射线照射人肺癌细胞株A549，探讨其对A549分化、增殖、凋亡以及放疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂人肺癌细胞株A549（货号：EY-X0574），购自上海一研生物科技有限公司；吡格列酮，购自美国Sigma 公司；RPMI-1640 培养基（货号：31800）、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（货号：P1200-50T）购于Solarbio 公司；胎牛血清FBS（货号：10099-141）、胰蛋白酶（货号：15050057）、青链霉素（货号：10378016），购自美国Gibco 公司；兔源GAPDH 抗体（货号：ab181602）、MUC-1 抗体（货号：ab45167）、SPC1 抗体（货号：ab174794）、SPC2 抗体（货号：ab186121）、羊抗兔二抗（货号：ab150077），购自美国Abcam公司；AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（货号：V13242），购自美国CellSingaling Technology 公司；结晶紫染液（货号：IC0600-1），购自上海恒斐生物科技有限公司；Matrigel基质胶（货号：356234），上海代轩生物科技有限公司；蛋白裂解液（货号：P0013K）、CKK-8试剂盒（货号：C0037）、伊红染色液（货号：C0109）、BCA 试剂盒（货号：P0011）等，购自上海碧云天公司。

1.2 仪器137Cs γ射线照射源（Autocell40），由加拿大原子能有限公司提供；酶标仪（Elx800），由美国Bio-Rad 公司提供；显微镜（Olympus CKX41），由德国Leica 公司提供；流式细胞仪（CytoFLEX），由美国贝克曼库尔特公司提供；双人单面超净工作台、C02培养箱，由Thermo 公司提供；电泳仪、制冰机、恒温水浴锅，由北京六一仪器厂提供；96 孔板、25 cm2培养瓶、60 mm培养皿，由上海碧云天公司提供等。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及分组处理 取购买的人肺癌细胞A549快速解冻复苏，接种于含有5 mL RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素）的25 cm2培养瓶内，置于37 ℃、5%二氧化碳的恒温培养箱中培养，隔天换一次培养基，当细胞长到80%以上时，胰酶消化后以1∶3的比例传代培养。传代的细胞随机分为对照组、2 Gy 组、4 Gy 组、6 Gy组、8 Gy组、10 Gy组，参照文献的方法［11］，以不同剂量的γ射线照射细胞，照射为一次性照射，剂量率为1 Gy/min，照射完成后，收集各组细胞备用。

1.3.2 细胞克隆形成实验 1.3.1 中收集的细胞以培养基重悬后计数，参照文献的方法［12］，将细胞以500 个/皿的密度接种在60 mm 培养皿中，并在37 ℃、5%二氧化碳的恒温培养箱中培养，隔天换一次培养基，7 d 后弃去培养基，PBS 漂洗2 次，用4%的多聚甲醛固定细胞30 min，PBS漂洗2次，用0.2%结晶紫染液染色15 min，PBS 漂洗2 次，对细胞集落数计数，计算各组细胞的相对细胞克隆形成，实验重复三次。公式为：相对细胞克隆形成＝照射组细胞集落数/对照组细胞集落数。

1.3.3 CKK-8 实验及放疗敏感性检测 1.3.1 中收集的各组细胞以培养基重悬后计数，将细胞以约5×105个/孔的密度接种于96 孔板，培养24 h 后加入CKK-8，继续培养2 h，于全自动酶标仪中振荡混匀后在450 nm 波长下检测各孔吸光度（optical density，OD），计算各组细胞生长抑制率，实验重复3 次。公式为：细胞生长抑制率（%）＝（1-实验组OD值/对照组OD 值）×100%，参照文献，放疗敏感性可用单位戈瑞（Gy）所造成的生长抑制率来表示［8］。

1.3.4 细胞凋亡检测实验 1.3.1 中收集的各组细胞以培养基重悬后计数，取约含有1×106个细胞的细胞悬液到离心管中，以1 000 r/min 的转速离心5 min，取细胞沉淀加入1 mL PBS 漂洗2 次，加入200 μL 的Binding Buffer 及10 μLArmexinV-FITC 轻轻震荡混匀，室温下避光反应15 min，加入300 μL 的Binding Buffer及5 μL PI轻轻震荡混匀，室温下再避光反应15 min，然后是以流式细胞仪检测，采用Muticycle AV软件分析数据，实验重复三次。

1.3.5 免疫印迹（western blot，WB）实验 1.3.1 中收集的各组细胞，加入蛋白裂解液后提取总蛋白，以BCA试剂盒测定蛋白浓度，根据结果调整各组蛋白弄得使之相同，以SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒根据说明书配方配制适宜浓度的SDS-PAGE 胶，取20 μg蛋白在电泳仪中进行电泳，转移目的蛋白至硝酸纤维膜上，加入5%的脱脂奶粉，室温下封闭2 h，分别加入适宜浓度的兔源GAPDH、MUC-1、SPC1、SPC2 一抗，4 ℃条件下孵育过夜，TBST 洗膜后加入适宜浓度的羊抗兔二抗，4 ℃条件下孵育2 h，以化学发光试剂显色，采用Image Lab软件分析蛋白条带得出蛋白的相对表达量，实验重复3次。

1.3.6 Transwell 侵袭实验 1.3.1 中收集的各组细胞以无血清的RPMI-1640 培养基重悬后计数，参照文献［13］，以5×105/mL 的密度接种在Matrigel 基质胶包被过的Transwell 上室，下室加入细胞培养基（含有10%FBS），在37 ℃、5%二氧化碳的恒温培养箱中培养24 h，取出小室，去除培养液，以PBS漂洗2次，加入4%的多聚甲醛，室温固定20 min，然后小心擦去基质胶及上室内细胞，加入0.5%的伊红染色，置于显微镜下观察并拍照，记录穿膜细胞数目，检测细胞侵袭能力。

1.4 统计学方法使用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。观测资料主要是计量数据，采用表示，以t检验比较两组间差异，以方差分析比较多组差异。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量的照射对肺癌细胞克隆形成的影响对照组、2 Gy组、4 Gy组、6 Gy组、8 Gy组、10 Gy组不同剂量照射分别对肺癌细胞相对克隆形成100%、（68.93±12.32）%、（41.59±0.01）%、（28.01±8.22）%、（22.20±6.21）%、（13.81±2.18）%，与对照组相比，照射组细胞相对细胞克隆形成降低且呈计量依赖性（F＝230.731，P＝0.000），见图1。

图1 不同剂量的照射对肺癌细胞克隆形成的影响：A为对照组，B为2 Gy组，C为4 Gy组，D为6 Gy组，E为8 Gy组，F为10 Gy组

2.2 不同剂量的照射对肺癌细胞增殖及放疗敏感性的影响与对照组相比，照射组细胞生长抑制率增高且呈计量依赖性（P＜0.05），照射组细胞的放疗敏感性呈下降趋势，且6 Gy 组、8 Gy 组、10 Gy 组与2Gy组相比差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 不同剂量的照射对肺癌细胞凋亡的影响对照组、2 Gy组、4 Gy组、6 Gy组、8 Gy组、10 Gy组照射对肺癌细胞凋亡率分别为（12.61±2.38）%、（30.62±3.45）%、（58.67±5.01）%、（71.81±8.03）%、（81.80±10.26）%、（94.41±12.17）%，与对照组相比，照射组细胞凋亡率增高且呈计量依赖性（F＝152.671，P＜0.001），见图2。

表1 各组细胞的生长抑制率及放疗敏感性（%，，n＝3）

表1 各组细胞的生长抑制率及放疗敏感性（%，，n＝3）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与2 Gy组比较，bP＜0.05

图2 不同剂量的照射对肺癌细胞凋亡的影响：A为对照组；B为2Gy组；C为4Gy组；D为6Gy组；E为8Gy组；F为10Gy组

2.4 不同剂量的照射对肺癌细胞分化的影响与对照组相比，照射组细胞MUC-1 蛋白表达降低，SPC1、SPC2 蛋白表达增高且呈计量依赖性（P＜0.05），见图3，表2。

图3 不同剂量的照射对肺癌细胞MUC-1、SPC1、SPC2蛋白表达的影响：A为对照组；B为2 Gy组；C为4 Gy组；D为6 Gy组；E为8 Gy组；F为10 Gy组

2.5 不同剂量的照射对肺癌细胞侵袭力的影响对照组、2Gy组、4 Gy组、6 Gy组、8 Gy组、10 Gy组浸出细胞数目分别为（402.87±53.31）、（300.12±38.43）、（189.64±29.86）、（121.21±22.32）、（71.04±18.29）、（20.31±4.03）个，与对照组相比，照射组细胞侵出细胞数目降低且呈剂量依赖性（P＜0.05），见图4。

图4 不同剂量的照射对肺癌细胞侵袭力的影响（×200）：A为对照组；B为2 Gy组；C为4 Gy组；D为6 Gy组；E为8 Gy组；F为10 Gy组

3 讨论

肺癌预后差、病死率高，我国每年约有60 万人因此死亡，严重威胁人民的身心健康和生活质量［14］。按病理类型，肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其发病机制还不十分清楚，可能由吸烟、长期遭受空气污染和职业中接触致癌物等引起［15］。放疗是临床中肺癌治疗的重要手段之一，研究发现不同剂量的X射线照射膀胱癌细胞，对其增殖、凋亡的影响不同，剂量越大，其抑制增殖、促凋亡的作用越强［16］。放疗会引起肿瘤细胞的辐射耐受性，随着治疗的进程，其放疗敏感度会降低，而加大放疗剂量极易引起严重的不良反应及并发症［17］，因此寻找合适剂量的放射剂量对肺癌的治疗具有重要意义。本文研究结果显示，与对照组比较，照射组细胞相对细胞克隆形成降低，生长抑制率、凋亡率表达增高且呈计量依赖性；照射组细胞的放疗敏感性呈下降趋势，且6 Gy组、8 Gy 组、10 Gy 组与2 Gy 组相比有统计学意义，4 Gy 组与2 Gy组相比也呈下降趋势，但在统计学上无意义，表明γ 射线照射可以抑制A549 细胞增殖，促进其凋亡，且随着照射剂量的加大效果增强，但A549 细胞的放疗敏感性随着照射剂量的加大呈下降趋势，当剂量达到6 Gy、8 Gy、10 Gy时放疗敏感性随照射剂量加大逐渐降低，揭示加大照射剂量，更有利于抑制肺癌细胞增殖，促进其凋亡，但其放疗敏感性会降低，继续增加剂量，可能对肺癌的疗效增加不多，还可能更易引起不良反应及后遗症。

表2 各组细胞MUC-1、SPC1、SPC2蛋白相对表达/（，n＝3）

表2 各组细胞MUC-1、SPC1、SPC2蛋白相对表达/（，n＝3）

注：与对照组比较，aP＜0.05

研究表明，癌细胞具有分化潜能，但其常出现分化缺失、分化阻断和分化异常，进而使其具有不死性，诱导肿瘤细胞分化，使其向正常细胞或近似正常细胞分化，可以降低其恶性程度，癌细胞恶性程度越高，其增殖能力、侵袭迁移能力越强［18］。粘蛋白1（Mucin-1，MUC-1）是一种肺组织分化标志物，在许多肿瘤组织细胞中都有表达，可作为肺癌细胞的分化标志，抑癌基因p16可协同维A酸下调A549细胞MUC1 的表达，诱导其分化，进而抑制其恶性增殖［19］，A549细胞是1972年Giard D J通过肺癌组织移植培养建系的肺癌细胞系，源自一位58岁的白人男性，属于腺癌人类肺泡基底上皮细胞，肺表面活性物质相关蛋白C（surfactant protein C，SPC）是肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性蛋白标志物，包括SPC 1及SPC2，采用低氘水长期培养A549 细胞，可显著上调SPC 1、SPC2的表达，提高细胞分化程度使其向正常肺泡Ⅱ型上皮细胞转化，抑制其增殖能力［20］。放疗可以杀伤肺癌细胞，但其对肺癌细胞的杀伤作用是否和分化有关，目前还不清楚，本文研究结果显示，与对照组比较，照射组细胞相对MUC-1蛋白表达、侵袭能力降低，SPC1蛋白表达、SPC2蛋白表达增高且呈计量依赖性，表明γ 射线照射可以上调SPC1、SPC2 蛋白表达，下调MUC-1蛋白表达，提高A549细胞分化程度，诱导其向正常肺泡Ⅱ型上皮细胞转化，降低其侵袭能力及恶性程度，且随着照射剂量的加大效果增强，揭示采用γ射线对肺癌进行放疗，可以诱导肺癌细胞分化，提高其分化成熟度，抑制其侵袭、增殖能力，进而使其恶性程度降低，另外相比正常细胞，癌细胞对射线更为敏感，促进肺癌细胞分化可能是随照射剂量加大，放疗敏感性逐渐降低的原因之一。

综上所述，γ 射线照射可以诱导A549 细胞分化，抑制其增殖、侵袭能力，促进其凋亡，且随着照射剂量的加大，上述各种作用效果增强，但A549 细胞的放疗敏感性随着照射剂量的加大呈下降趋势，其机制可能与促进肺癌细胞向正常肺泡Ⅱ型上皮细胞转化有关，本文为临床放疗的剂量选择提供了一定的参考，但本研究未探讨放疗对正常细胞的影响，并且放疗的作用机制也未做明确研究，还存在不足，需要后续的进一步研究。