微管相关蛋白样激酶1 在胃癌组织中的表达及其临床意义

贾长河，谢毅，袁媛，刘博伟，任颖

作者单位：河南省人民医院，a消化科，b胃肠外科，c病理科，河南 郑州 450003

微管相关蛋白样激酶1（Doublecortin-like kinase 1，DCLK1）是一种微管相关蛋白（microtuble-associated proteins，MAPs），主要表达在肿瘤干细胞，被认为是胃肠道肿瘤干细胞标志物［1］，以往的研究显示，DCLK1 高表达与结肠癌［2］、膀胱癌［3］和肺癌［4］等癌症的发生与转移有关。本研究通过免疫组化的方法检测比较胃癌组织和癌旁正常组织中DCLK1的表达，分析DCLK1表达对胃癌发生发展及预后的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2006年5 月至2011年7 月在河南省人民医院胃肠外科行胃癌根治术的267例胃癌病人的临床资料，其中男170 例，女97 例；年龄（54±13）岁；中高分化腺癌129 例，低分化腺癌138例；T1～T2 期144 例，T3～T4 期123 例；神经侵犯153例，无神经侵犯114 例；脉管侵犯139 例，无脉管侵犯128 例；淋巴转移206 例，无淋巴转移61 例；临床分期Ⅰ～Ⅱ期111 例，Ⅲ～Ⅳ期156 例。排除远处转移病例。同时选取癌旁正常组织标本138例作为对照。病人或其近亲属对本研究知情同意，签署了知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 组织来源及试剂267例胃癌标本及138例癌旁正常组织学标本来自河南省人民医院病理科保存的石蜡包埋组织标本，切片均经HE 染色复读确认，术前未接受放化疗。DCLK1 单克隆抗体（美国Abcam 公司，货号：ab109029）。免疫组织化学试剂盒和DAB显色液均购自武汉proteintech公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学检测DCLK1 的表达 按免疫组织化学法的试剂盒说明书严格操作，一抗DCLK1单克隆抗体工作浓度为1∶100，每批染色均设立阴性对照（PBS液代替一抗）和阳性对照。所有切片采用盲法由两名高年资病理科医生进行独立判定。在光学显微镜下观察，阳性细胞出现棕褐色染色，免疫组化结果采用细胞染色阳性率和着色强弱双评分半定量法进行评价，在显微镜下随机选择10个高倍视野（×400），每个视野统计100个细胞，计算染色阳性的细胞比例，按照细胞染色阳性率对其评分为1～4 分，分别代表染色阳性率≤25%，26%～50%，51%～75%，76%～100%。着色强弱范围评分为0～3分，分别代表无着色，淡黄色，棕黄色，棕褐色。细胞染色阳性率与着色强弱的乘积分组：＞4 分为高表达组，≤4分为低表达组。

1.3.2 临床资料收集 首先在病理科查找2006年5月至2011年7月期间病理确诊为胃癌的病人资料，包括性别、年龄、病理分型、有无淋巴转移、有无脉管侵犯和临床分期等。

1.3.3 随访 通过复诊、电话、微信和邮件等方式进行随访，记录每例病人的生存状况，术后是否复发及复发时间，复发是指局部区域复发或/和远处转移，根据病理活检或2个以上影像学检查确定，不能确定复发的按不复发计，对于失访或因非肿瘤原因导致的死亡按删失数据计，随访截止时间为2016年10 月。统计分析5年总生存期（overall survival，OS）和5年无病生存率（disease-free survival，DFS）。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0 进行统计学分析。计数资料以例（%）表示，组间比较/单因素分析采用χ2检验。对于单因素分析中P≤0.10 的因素代入Cox 比例风险回归模型分析预后的独立影响因素。以Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank法比较生存率的差异。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 胃癌病人临床病理学特征及与DCLK1表达的关系DCLK1 主要在胃组织的细胞浆内呈棕黄色颗粒，DCLK1在癌旁正常组织和胃癌组织中均有表达，见图1。

267 例胃癌组织中有232 例呈阳性表达，其中192 例为高表达，40 例为低表达，35 例为阴性。138例癌旁正常胃组织中有58例呈现阳性表达，其中36例为高表达，22 例为低表达，80 例阴性。胃癌组织中DCLK1总体表达率（86.9%，232/267）及高表达率（71.9%，192/267）均高于癌旁正常组织（42.0%，58/138；26.1%，36/138），差异有统计学意义（均P＜0.001）。见表1。

表1 DCLK1在胃癌及癌旁正常胃组织中的表达率/例（%）

DCLK1高表达与病人性别、年龄，肿瘤大小，位置等无关（P＞0.05）；与肿瘤分化程度，浸润深度，神经侵犯，脉管侵犯，淋巴转移及临床分期等临床病理因素有关（P＜0.05），见表2。

2.2 影响胃癌病人预后的Cox 分析将上述几个单因素存在统计学意义的自变量分别赋值（DCLK1低表达＝1，DCLK1高表达＝2；分化程度低＝1，分化程度高/中＝2；浸润深度T1/T2＝1，T3/T4＝2；脉管侵犯＝1，脉管未侵犯＝2；淋巴转移＝1，淋巴未转移＝2），生存分别赋值为生存＝1，死亡＝0，无复发生存分别赋值为：复发生存＝1，无复发生存＝0，将自变量和因变量纳入Cox分析，用Forward Conditional 逐步回归分析，找出影响预后的独立因素。

对5年OS 的Cox 分析显示：DCLK1 表达、分化程度，浸润深度和临床分期是总生存（OS）的独立影响因素，见表3。对5年无复发生存率（DFS）的Cox分析显示：DCLK1 表达，分化程度，淋巴转移，临床分期是5年无复发生存率的独立影响因素，见表4。

表2 DCLK1表达与胃癌临床病理特征的关系

表3 Cox多因素回归分析胃癌OS的影响因素

表4 Cox多因素回归分析胃癌DFS的影响因素

2.3 DCLK1表达水平与病人生存预后分析截至2016年10月，267例病人中共有23例失访，5例死于其他疾病，其中高表达组失访12例，2例死于其他疾病，低表达组失访11例，3例死于其他疾病。自手术之日起至死亡或随访截止，最长生存期为125.32个月，最短生存期5.6个月，中位生存期为32.68个月。DCLK1高表达组5年总生存率为56.10%，无病生存率为39.70%，中位生存期为26.38个月；DCLK1低表达组5年总生存率为68.90%，无病生存率为47.70%，中位生存期为42.63个月。Kaplan-Meier 生存分析显示（图2），与DCLK1 低表达的病人相比，DCLK1 高表达的胃癌病人的5年总生存率（χ2＝4.232，P＝0.040）和5年无病生存率（χ2＝3.905，P＝0.048）均较差。

图2 Kaplan-Meier法分析DCLK1表达对胃癌病人5年总生存率和无病生存率的影响：A为总生存率；B为无病生存率

3 讨论

在世界范围，胃癌的发生率和死亡率在过去几十年中虽然下降，但依然是排名第四的最常见的恶性肿瘤，排名第二的癌症相关致死因素，是人类健康的重大威胁［5-6］。手术切除是唯一可能根治胃癌的治疗方法，特别是对于处于疾病早期的胃癌病人［7］。但是对于许多胃癌病人来说，早期症状不典型，确诊时已经处于疾病晚期阶段，由于肿瘤转移和术后复发率很高，晚期胃癌病人通常在术后24个月内发生死亡，预后很差［8-9］。为了提高胃癌早期诊断，有必要发展更加可信的生物标志物以预测病人临床结局。

微管相关蛋白DCLK1 最早被发现是小肠毛细胞（tuft cell）标志［10］，后续的研究发现DCLK1标记肠道和胰腺肿瘤干细胞［11-12］，结肠癌和胰腺癌的发生和进展依赖DCLK1阳性细胞［11，13-15］。肝癌、结肠癌、胰腺癌和食管癌等癌症中均高表达DCLK1［12，16-19］。DCLK1 的表达对于肿瘤干细胞、癌症生长及转移均具有重要作用［20-22］。但是DCLK1 在胃癌中的表达以及对胃癌诊断治疗预后的意义研究的较少。本研究通过免疫组化检测比较了267 例胃癌组织及138 例癌旁正常组织中DCLK1 的表达，分析DCLK1 表达与胃癌临床病理学特征及预后的关系，结果表明，胃癌组织中DCLK1 高表达率显著高于癌旁正常组织，DCLK1 高表达与肿瘤分化程度、浸润深度、神经侵犯、脉管侵犯、淋巴转移、临床分期等临床病理因素有关。Fan 等［23］的研究结果表明：DCLKl 高表达的肝癌病人无病生存期明显缩短（HR＝1.546，95%CI：1.330～1.725）。梁东等［24］研究发现DCLKl 高表达的肝癌病人3年无瘤生存率（16.7%）明显低于低表达者（46.2%）。孟庆彬等［25］的研究结果提示：胃癌病人中DCLKl 高表达者的5年生存率和5年无瘤生存率分别为39.0% 和37.0%，明显低于DCLKl 低表达者的65.8% 和64.5%，以上研究报道均提示DCLKl 高表达的病人预后较差。本研究结果显示：胃癌病人中DCLK1高表达组5年总生存率和无复发生存率均低于DCLK1 低表达组。Cox 分析提示，DCLK1 高表达是胃癌病人总体生存率和无复发生存率的独立影响因素，提示DCLKl 高表达的胃癌病人预后较差，同上述文献报道的结果一致。

综上所述，DCLK1 是胃癌潜在的生物标记分子，可以作为一种新的胃癌的靶标，开发新的诊治方法以及判断预后的方法。