干扰素α和胸腺五肽协同干预对HepG2.2.15细胞APOBEC3A和APOBEC3B mRNA表达的影响

熊 芳，高 耀，马艳品，于乐乐，谭炳琴，鲍旭丽，闾 军

首都医科大学附属北京佑安医院 肝病与肿瘤生物治疗科，北京 100069

HBV共价闭合环状DNA (cccDNA)是病毒复制过程中产生的一种重要复制中间体，在细胞核内积聚，现有抗病毒药物不能清除, 是肝细胞持续感染和抗病毒治疗后产生耐受和停药后复发的关键[1]。既往研究[2]发现IFNα和胸腺五肽(thymopentin，TP5)可协同作用降低HepG2.2.15细胞内cccDNA，但具体的机制未明。载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 3, APOBEC3)家族包含7位成员，包括APOBEC3A(简写为A3A，下同)、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G和A3H，具有胞苷脱氨基活性，其中多个成员与机体抵抗病毒感染的先天性免疫有关[3]。IFNα直接作用于细胞IFNα/β受体从而上调APOBEC3A表达；而淋巴毒素β-受体(1ymphotoxin-β receptor，LTβR)特异性激动剂可激活LTβR从而上调APOBEC3B表达。上调的APOBEC3A/B均可通过HBV核心蛋白引导而作用于cccDNA脱氨基作用，从而在细胞内切酶作用下降解cccDNA[4]。本研究观察IFNα和TP5协同干预HepG2.2.15细胞APOBEC3A、APOBEC3B基因表达水平的变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料 转染HBV全基因组的人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞由本院肝病研究所保存；IFNα为人IFNα-1b注射液，购自北京三元基因工程有限公司，TP5购自北京双鹭公司产品。APOBEC3A、APOBEC3B及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)引物由上海捷瑞生物工程有限公司生物公司合成。DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒购自德国Qiagen公司，plasmid safe DNase Ⅰ购自美国Epicentre公司，TRIzol试剂购自美国Sigma公司，反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，SYBR Premix Ex Taq试剂购自日本TaKaRa公司。

1.2 细胞培养 HepG2.2.15细胞在DMEM培养基加入10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、链霉素(0.1 mg/ml)，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 细胞处理 取处于对数生长期的5×104个HepG2.2.15细胞接种于48孔板中，分别设立空白对照组、IFNα组、TP5组及IFNα联合TP5组，每组设立3个复孔。分别处理12、24、48和72 h收集细胞。IFNα的浓度为2、5 KU/ml，TP5的浓度为5、10 μg/ml。

1.4 cccDNA的检测 用DNeasy Blood & Tissue Kit提取细胞DNA, DNA经plasmid safe DNase Ⅰ处理，利用Taqman实时定量PCR检测cccDNA。具体的引物和详细方法见参考文献[2]。

1.5 反转录实时定量PCR法检测APOBEC3A、APOBEC3B的表达 应用Trizol试剂提取细胞总RNA。取2 μl测定样品在260 nm和280 nm的A值，确定RNA的浓度，A260/A280比值在1.8～2.0视为抽提RNA无蛋白污染。将总RNA反转录为cDNA，反应体系如下： 5×Reverse Transcription Buffer 2 μl，RNase Inhibitor 0.5 μl，Reverse Transcriptase 0.5 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，随机引物 1 μl，Nuclease-free water 4 μl，RNA模板(20 ng/μl) 1 μl，总反转录体系为10 μl。反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。将反转录产物稀释10倍，-80 ℃保存。

利用SYBR实时定量PCR法对APOBEC3A、APOBEC3B进行定量检测，PCR反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq 10 μl ，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μl，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μl，cDNA 2 μl，灭菌水7 μl，反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。APOBEC3A上游引物：5′-AGATGGAGTCTGGTACTGTCG-3′，APOBEC3A下游引物：5′- GAGGCAGGAGAGTAGCGT -3′；Tm值分别为60.2 ℃、59.9 ℃，扩增片段大小为98 bp。 APOBEC3B上游引物：5′-GACAGGGACAAGCGTATCTAAG-3′，APOBEC3B下游引物：5′-TCACTTCATAGCACAGCCAAG -3′；Tm值分别为59.5 ℃、59.8 ℃，扩增片段大小为149 bp。 GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，GAPDH下游引物： 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGG A-3′；Tm值分别为63.0 ℃、63.1 ℃，扩增片段大小为138 bp[4]。目的基因和内参基因融解曲线均可见单一峰。目的基因与管家基因的扩增效率均为99%。应用2-△△CT法对目的片段的相对表达水平进行分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFNα对APOBEC3A、APOBEC3B mRNA表达的影响

笔者前期研究[2]发现IFNα组可降低HepG2.2.15细胞cccDNA水平，但是只在IFNα浓度高达5 KU/ml，作用时间为24 h时明显(图1a)。为此，观察了2、5 KU/ml IFNα作用于HepG2.2.15细胞在不同时间点对APOBEC3A、APOBEC3B表达的影响。如图2所示，2 KU/ml IFNα与空白对照组相比，在12、24、48和72 h均能提高APOBEC3A的表达水平(P值均<0.001)；5 KU/ml IFNα与空白对照组相比，在12、24、48和72 h亦能提高APOBEC3A的表达水平(P值均<0.001)。 APOBEC3B的表达水平未见升高。

注：*与空白对照组相比，P<0.001。

注：*与空白对照组相比，P<0.001。

2.2 TP5对APOBEC3A、APOBEC3B mRNA表达的影响 笔者前期研究发现低浓度5 μg/ml TP5组不能降低HepG2.2.15细胞cccDNA水平，而较高浓度10 μg/ml TP5组能降低HepG2.2.15细胞cccDNA含量(图1b)。观察了5、10 μg/ml TP5作用于HepG2.2.15细胞在不同时间点对APOBEC3A、APOBEC3B表达的影响。结果发现，与空白对照组相比未见明显变化(P值均>0.05)(图3)。APOBEC3B的表达未见变化。

图3 不同浓度TP5干预对APOBEC3A mRNA水平的影响

2.3 IFNα联合TP5对APOBEC3A、APOBEC3B mRNA表达的影响 笔者前期研究发现2 KU/ml IFNα联合5、10 μg/ml TP5组作用于HepG2.2.15细胞72 h可显著降低cccDNA水平(图1c)。观察了2 KU/ml IFNα联合5、10 μg/ml TP5组作用于HepG2.2.15细胞在不同时间点对APOBEC3A、APOBEC3B表达的影响。如图4所示，2 KU/ml IFNα联合5 μg/ml TP5与空白对照组相比,在12、24、48和72 h均能提高APOBEC3A的表达水平(P值均<0.001)；2 KU/ml IFNα联合10 μg/ml TP5与空白对照组相比，在12、24、48和72 h亦能提高APOBEC3A的表达水平(P值均<0.001)；与2 KU/ml IFNα相比，2 KU/ml IFNα联合5 μg/ml TP5组和2 KU/ml IFNα联合10 μg/ml TP5组在12、24、48和72 h均可明显提高APOBEC3A的表达水平(P值均<0.001)。APOBEC3B mRNA表达未见变化。

3 讨论

笔者前期研究[2]发现IFNα和TP5可协同作用降低HepG2.2.15细胞内cccDNA，具体的机制未知。本研究表明IFNα联合TP5可作用于HepG2.2.15细胞，显著提高APOBEC3A的表达来降解cccDNA。为临床上TP5联合IFNα的抗HBV作用提供了新机制。

注：*与空白对照组相比，P<0.001；#与2 KU/ml IFNα组相比，P<0.001。

APOBEC3A、APOBEC3B属于APOBEC3家族，是一类可抑制逆转录病毒复制的酶。APOBEC3家族的所有成员都具有脱氨基作用。体内、体外实验和临床试验表明IFNα可以诱导部分APOBECs表达上调[5-7]。研究[8]表明IFNα可通过上调APOBEC3A的表达来发挥对HBV cccDNA的脱氨基作用，在cccDNA上形成脱嘌呤嘧啶位点，使得cccDNA被核酸裂解酶识别而降解，从而显著降低细胞内cccDNA。但是这种作用，在IFNα较高浓度时明显。

本研究发现低浓度的TP5单独对细胞内APOBEC3A的表达并无影响。TP5降低cccDNA的具体机制可能不是通过提高细胞内APOBEC3A这条通路，具体的机制还需要进一步研究。但是TP5联合IFNα可显著提高细胞内APOBEC3A mRNA的表达，与IFNα单独提高APOBEC3A的表达相比，两者差异有统计学有意义。提示在临床实践中，TP5联合IFNα对HBV的治疗是有益的。但是本实验方法只是局限于real-time PCR方法所测，可进一步完善蛋白水平检测数据和基因沉默实验，将会使结果更加全面。

TP5是一类免疫调节剂，可增强机体非特异性免疫功能，在我国广泛用于慢性乙型肝炎的治疗。可增强慢性肝炎患者CD4+、CD8+T淋巴细胞成熟及分化，改善T淋巴细胞亚群水平及比例，通过增加CD4+/CD8+比值并延长细胞亚群的寿命，增强机体免疫力，通过活化辅助性T淋巴细胞并诱导抑制性T淋巴细胞来发挥作用[9]。本研究表明，TP5和IFNα的联合作用可降解cccDNA, 其中一个的机制是通过协同作用提高细胞内APOBEC3A mRNA的表达。