人参皂苷Rg3抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞过度增殖、炎症反应和PTX3的表达

2020-02-08杜世豪王梦影王增阳范华英

烟台大学学报（自然科学与工程版） 2020年1期

冀凯,杜世豪,李新,王宇,王梦影,岳光,王增阳,范华英

(烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心、分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),山东烟台 264005)

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最严重的血管并发症之一,在我国有33.6%的糖尿病患者会发展成为DN[1].目前,临床上主要通过控制生活方式和饮食或者利用降糖药等方式控制疾病的发展速度,并不能有效地治疗DN[2]．因此,寻找针对新靶点治疗的新型药物具有重要的临床价值．

由高血糖和高血压引起的代谢和血液动力学改变被认为是导致糖尿病患者肾损伤的可能原因之一[3]．在DN发病早期,会出现肾小球系膜细胞过度增殖、细胞外基质积聚等病理表现．单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)在炎症反应中扮演着重要的角色,高糖(HG)及其介导的炎症反应是DN公认的致病因素之一[4-6]．长五聚体蛋白PTX3在炎症部位由多种细胞产生[7],该蛋白与多种临床疾病相关,包括冠状动脉疾病,类风湿性关节炎和慢性肾病等[8-9]．DN是一种低度慢性炎症性疾病[10],目前临床研究报道,DN患者中PTX3的血浆水平和肾脏沉积增加,且与24 h尿蛋白水平呈正相关,提示PTX3与DN的发展有关,改变血浆PTX3水平可能有助于缓解DN的疾病进程[11-12]．因此,在DN的发病过程中,通过调节炎症反应,抑制HG诱导的系膜细胞增殖和PTX3的表达可以有效缓解肾小球的硬化,从而达到缓解DN的目的．

近年来的临床试验表明,中医对本病的治疗具有一定的优势．中药人参作为五加科植物人参的干燥根和根茎,在炎症、糖尿病、心血管疾病等方面均有治疗作用[13]．人参含有多种有效成分,其药理作用主要归因于人参皂苷,人参皂苷具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性[14]．已有研究表明,人参皂苷Rg3(图1)对糖尿病大鼠的肾脏具有保护作用,能在一定程度上延缓糖尿病大鼠肾脏的纤维化进展[15]．同时,人参皂苷对多种肾脏疾病均具有一定的保护作用[16-17]．因此,本研究通过建立HG诱导的系膜细胞体外模型,检测人参皂苷Rg3对系膜细胞增殖,炎症反应及PTX3表达的影响,并初步评价其作用机制,为人参皂苷Rg3在临床治疗DN的开发和应用提供一定的理论基础．

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株人肾小球系膜细胞购自中国科学院细胞库(中国上海)．所有细胞在补充有10%胎牛血清(Invitrogen, USA)的RPMI 1640培养基(Hyclone, USA)中,在37 ℃,5%CO2湿润的环境中培养．

1.1.2 实验仪器与设备 150i二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司),HCB-1300V垂直层流洁净工作台(青岛海尔特种电器有限公司),TDZ4台式低俗离心机(湖南赫西仪器装备有限公司),CKX41奥林巴斯倒置显微镜(北京长恒荣创科技有限公司),BCD-231U电冰箱(北京海信电器有限责任公司),TB-215D电子分析天平(美国丹佛仪器公司),移液器(德国Eppendrof公司),SpectraMax M3型酶标仪(美谷分子仪器有限公司),荧光显微镜(美国BioTek仪器有限公司)．

1.1.3 药品与试剂人参皂苷Rg3由山东靶点药物研究有限公司(中国山东)提供;MCP-1,PTX3 ELISA试剂盒购自R&D Systems(Minneapolis,MN,USA);针对NF-κB p65,IκBα和IKKβ的抗体购自Santa Cruz Biotechnology Inc.(Dallas,Texas,USA);PTX3抗体购自Abcam(Cambridge,MA,USA)．

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组将正常培养的人肾小球系膜细胞分为5组:正常对照组(NG)、高糖诱导组(HG)、高糖+不同浓度梯度人参皂苷Rg3干预组(HG+Rg3)．

1.2.2 MTT法检测人参皂苷Rg3对高糖诱导的系膜细胞增殖的影响根据实验分组,取对数生长期的人肾小球系膜细胞,将细胞消化计数并接种在96孔板中,每孔大约6 000个细胞,培养箱中孵育过夜,用于细胞活力测定．除正常组外,其他各组均加入高糖(葡萄糖浓度为30 mmol/L)诱导,在24 h后加入不同浓度的人参皂苷Rg3继续培养不同时间点(12 h,24 h,48 h,72 h),每组设置3个复孔．分别培养相应预设时间后,加入MTT溶液(浓度为5 mg/mL)继续孵育4 h．去除上清液,加入150 μL DMSO到细胞中以溶解甲瓒．设置酶标仪波长为570 nm,分别在12 h、24 h、48 h和72 h测量吸光度．由未处理的细胞组成的对照组被认为具有100%的活细胞．结果表示为与对照组相比的活细胞的百分比．

1.2.3 ELISA法检测高糖诱导的MCP-1和PTX3表达按实验分组分别进行给药处理,除空白对照组外,其他五组每孔都替换为高糖培养原液．孵育24 h之后,再依次加入稀释好的不同浓度的人参皂苷Rg3于培养箱中继续培养24 h．收集5组细胞的上清液并离心,根据人源PTX3和MCP-1的酶联免疫分析试剂盒说明书,在酶标仪450 nm波长处对MCP-1和PTX3的表达情况进行检测．

1.2.4 免疫荧光法检测高糖诱导的PTX3表达根据实验分组要求,接种96孔板并做给药处理,加药处理完毕后置于含5% CO2的37 ℃培养箱中培养24 h．给药24 h后,弃去上清,用PBS清洗1遍后加入多聚甲醛用于固定细胞,放入培养箱中5 min后,弃去多聚甲醛,用PBS清洗3遍,再选择Triton-X100透化5 min,继续用PBS清洗3遍．每孔依次加入BSA溶液于培养箱中孵育2 h．之后吸出孔内封闭液,用稀释好的PTX3抗体孵育,4 ℃冰箱过夜．孵育完毕后室温静置15 min,将抗体工作液吸出,用PBS清洗3遍,再加入BSA稀释的荧光二抗,避光孵育2 h．用PBS稀释的细胞核染料DAPI进行细胞核染色,室温孵育30 min．再吸出DAPI,用PBS清洗3遍后再分别加入100 μL PBS及一滴抗荧光猝灭剂．用荧光显微镜拍照成像．

1.2.5 Western-Blot法检测人参皂苷Rg3对PTX3,MCP-1及NF-κB信号通路相关蛋白表达水平的影响在“1.2.1”的实验分组基础上,添加高糖+NF-κB阻断剂PDTC组(HG+PDTC)．在人参皂苷Rg3作用24 h后,弃去培养液,用预冷的PBS冲洗细胞3遍．再将PMSF加入到冰冷的裂解液中(最终稀释浓度为1∶100),取适量混合液加入到细胞上4 ℃裂解0.5 h．离心后提取上清液(12 000 r/min,4 ℃,10 min),并使用BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime,China)测量蛋白浓度．用SDS-PAGE上样缓冲液煮沸5 min．用10%SDS-PAGE凝胶分离蛋白质提取物,然后转移到PVDF膜上．接下来,将PVDF膜在封闭缓冲液(5%的脱脂奶粉溶于含有Tween-20的Tris缓冲盐溶液中,在室温下制备)中孵育4 h．在4 ℃下将PVDF膜与一抗孵育过夜．用TBST洗涤膜3次,然后与相应的二抗室温孵育1 h．最后,使用ECL蛋白印迹检测试剂盒(Beyotime,中国)检测蛋白条带,并使用ImageQuant LAS 4000拍照处理．

1.3 统计学方法

2 实验结果

2.1 人参皂苷Rg3对高糖诱导人肾小球系膜细胞增殖的抑制作用

经由MTT实验检测各组细胞的吸光度,检测结果如表1所示,在HG诱导72 h内的4个检测时间点,随着作用时间的延长,HG组同一时间点与NG组比较吸光度均有一定程度的增高．与HG组相比,不同浓度人参皂苷Rg3干预后的吸光度呈现一定程度的降低．如图2所示,对于相同的药物作用时间,随着人参皂苷Rg3浓度的升高,对人肾小球系膜细胞增殖的抑制作用逐渐增强．另外,同一浓度下的人参皂苷Rg3对系膜细胞的抑制作用随着作用时间的延长也随之增强．

图2不同浓度人参皂苷Rg3在不同时间点对HG诱导系膜细胞增殖的抑制率变化

Fig.2TheinhibitionrateofHG-inducedMCproliferationatdifferenttimepointsbydifferentconcentrationsofGin-senosideRg3

表1 不同浓度人参皂苷Rg3对HG诱导的系膜细胞增殖的吸光度变化

注:与空白对照组相比,###P<0.001;与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

2.2 人参皂苷Rg3对高糖诱导的MCP-1和PTX3表达的影响

2.2.1 ELISA法检测高糖诱导的MCP-1和PTX3表达实验结果如图3所示,与NG组相比,HG组系膜细胞中MCP-1的表达明显增加(P< 0.01)．与HG组相比,人参皂苷Rg3 12.5 μmol/L组(P<0.05)和人参皂苷Rg3 25 μmol/L组(P< 0.01)均能一定程度的抑制MCP-1的表达,人参皂苷Rg3 50 μmol/L组(P<0.01)对MCP-1表达的抑制效果明显优于其他两组(图3(a))．HG组PTX3的表达较正常组也明显增加(P<0.01)．与HG组相比,人参皂苷Rg3 25 μmol/L组和人参皂苷Rg3 50 μmol/L组对PTX3表达的抑制效果明显优于人参皂苷Rg3 12.5 μmol/L组(图3(b))．

2.2.2 免疫荧光法检测高糖诱导的PTX3表达免疫荧光实验结果如图4所示,与空白对照相比,HG组PTX3表达显著增加．人参皂苷Rg3不同浓度组均能一定程度地抑制HG诱导的PTX3过度表达．人参皂苷Rg3 50 μmol/L组抑制PTX3的表达效果明显优于其他2个剂量组．

2.3 人参皂苷Rg3对PTX3,MCP-1及NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

通过Western-Blot实验检测NF-κB通路活化的结果如图5、6所示,与NG组相比,HG组NF-κB p65(P<0.001)的蛋白表达有明显的增加;并且,IκBα(P<0.001)蛋白的表达有明显的降低,表明NF-κB通路的被激活．然而,与HG组相比,人参皂苷Rg3 12.5 μmol/L组和人参皂苷Rg3 25 μmol/L组能够抑制NF-κB p65的表达同时上调IκBα的表达．人参皂苷Rg3 50 μmol/L组对NF-κB p65(P<0.001)表达的抑制作用和对IκBα(P<0.01)表达的上调作用明显优于其他2组．另外,PDTC组也能明显抑制NF-κB p65表达,同时抑制了IκBα的降解．通过Western-Blot对MCP-1和PTX3蛋白表达的检测结果如图7、8所示,与NG组相比,HG组MCP-1(P<0.001)和PTX3(P<0.001)的表达均有明显的增加．人参皂苷Rg3 12.5 μmol/L组对HG诱导的MCP-1和PTX3表达的抑制作用并不明显．然而,人参皂苷Rg3 25 μmol/L组和人参皂苷Rg3 25 μmol/L组均能一定程度的抑制HG诱导的MCP-1和PTX3的过度表达,且具有显著性差异．同样与HG组相比,PDTC组也明显抑制了MCP-1和PTX3的表达,与人参皂苷Rg3干预组的效果相同．

与空白对照组相比,###P< 0.001;与高糖组相比,*P< 0.05,**P< 0.01.

图5人参皂苷Rg3对NF-κB p65蛋白表达的影响

Fig.5 The effect of Ginsenoside Rg3 on the expression of NF-κB p65

与空白对照组相比,###P<0.001;与高糖组相比,*P< 0.05,**P<0.01.

图6人参皂苷Rg3对IκBα蛋白表达的影响

Fig.6 The effect of Ginsenoside Rg3 on the expression of IκBα

与空白对照组相比,###P<0.001;与高糖组相比,*P<0.05,***P<0.001.

图7人参皂苷Rg3对MCP-1蛋白表达的影响

Fig.7 The effect of Ginsenoside Rg3 on the expression of MCP-1

与空白对照组相比,###P<0.001;与高糖组相比,*P<0.05,***P<0.001.

图8人参皂苷Rg3对PTX3蛋白表达的影响

Fig.8 The effect of Ginsenoside Rg3 on the expression of PTX3

3 讨论

DN属于继发性肾病中的一种,是糖尿病最严重的微血管并发症之一．系膜细胞是肾小球内具有活跃功能的固有细胞,它的过度增殖被认为是DN的重要病理特征之一．越来越多的研究表明,HG诱导的系膜细胞的过度增殖可能促进DN的疾病进展[18]．同时,HG培养下的系膜细胞也经常被用作在DN早期阶段观察到细胞增殖的体外模型．因此,本研究选择肾小球系膜细胞作为研究对象,在含HG的培养基中培养时观察到系膜细胞的过度增殖,这与先前研究的结果一致．

人参皂苷Rg3是人参皂苷发挥作用的有效活性单体之一,具有减轻炎症反应、减少氧自由基、抗氧化等一系列药理活性．据报道,人参皂苷Rg3能够有效改善糖尿病大鼠的肾脏病理损害,并降低血糖、血肌酐及24 h尿蛋白含量,具有一定的肾脏保护作用[15]．为了研究人参皂苷Rg3对DN中HG诱导的系膜细胞过度增殖的影响,进行了MTT检测实验,实验结果表明,与HG组相比,不同浓度人参皂苷Rg3均对系膜细胞的增殖呈现不同程度的抑制作用,对于同一浓度的人参皂苷Rg3而言,随着作用时间的延长,其抑制系膜细胞增殖的效果也随之增强;对于同一作用时间,随着人参皂苷Rg3浓度的升高,其抑制系膜细胞增殖的作用也明显增强．其中在人参皂苷Rg3浓度为25 μmol/L时,药物作用时间在48 h时抑制作用最强．由此证明,人参皂苷Rg3能够有效抑制HG诱导的系膜细胞过度增殖,且具有时间剂量依赖效应．

炎症反应是DN重要的发病机制之一,高血糖、脂代谢紊乱引发的多种炎症因子的释放促使DN中炎症反应的发生．异常环境下可以引起多种炎症因子,如肿瘤坏死因子(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6),转化生长因子β1(TGF-β1),单核细胞趋化因子(MCP-1)等的产生和释放,且该过程均涉及经典炎症通路NF-κB信号通路[19]．有研究表明在糖尿病肾病大鼠模型中,人参皂苷Rg3对TNF-α,TGF-β1表达存在一定的抑制作用[15]．但是MCP-1作为一种伴随炎症反应发生的趋化因子和DN发生发展过程中的关键致硬化因子,其同时又与DN患者血清白蛋白和尿蛋白水平明显相关[20]．MCP-1超过基本水平的过表达会一定程度加重肾脏损伤,且还与多种慢性肾病及纤维化过程关系密切[21]．最新的研究表明PTX3是局部炎症反应的敏感生物标志物,并且在DN中高表达的PTX3水平与疾病发展密切相关,可能参与DN的发病过程[11-12]．因此，本研究通过ELISA法检测了人参皂苷Rg3对MCP-1和PTX3表达的影响,结果表明,与正常对照组相比,HG诱导下MCP-1和PTX3的表达含量明显增多,人参皂苷Rg3对MCP-1和PTX3的表达有一定的抑制作用,并且在浓度为50 μmol/L时抑制效果最为显著．为了进一步证明人参皂苷Rg3对PTX3表达的抑制作用,在后续又进行了免疫荧光实验,实验结果表明,与NG组相比,HG诱导组的荧光信号极为强烈,证明PTX3的表达明显增多．在加入不同浓度人参皂苷Rg3进行干预后荧光信号呈现一定程度的减弱,与ELISA的实验结果一致．

NF-κB是细胞内一种重要的核转录因子,参与了许多细胞因子及受体蛋白等基因的表达调控．在正常情况下,它以三聚体形式存在于胞浆中;在人体内达到高血糖状态时,NF-κB信号通路被激活,随即产生以MCP-1为代表的大量下游炎症因子,加重肾组织损害．由于PTX3的基因位点上含有NF-κB的启动子,活化的NF-κB发生核移位后可启动PTX3的表达．在这个过程中,我们猜想人参皂苷Rg3是否可以通过抑制NF-κB信号通路的激活,从而降低MCP-1和PTX3的表达．因此,为了进一步探寻人参皂苷Rg3对MCP-1和PTX3表达抑制过程中的机制,本实验进而选择了NF-κB阻断剂PDTC作为对照．本研究采用Western-Blot实验,结果表明与NG组相比,HG培养下NF-κB p65的蛋白表达水平明显升高,IκB-α蛋白表达明显降低;PDTC组能够明显抑制NF-κB信号通路的激活;在加入人参皂苷Rg3后,同样可以明显抑制NF-κB通路的激活,其中人参皂苷Rg3 50 μmol/L组抑制效果最明显,与PDTC组作用效果相当．同时,在HG刺激下,PTX3,MCP-1的蛋白表达显著升高,PDTC组可以明显下调MCP-1和PTX3的表达,人参皂苷Rg3干预后也能一定程度的抑制HG诱导下的MCP-1和PTX3表达．综上所述,本研究实验结果阐明了HG可诱导系膜细胞的增殖,且可显著上调MCP-1和PTX3的表达,而且这个过程可能是通过NF-κB信号通路的激活介导的．而人参皂苷Rg3在50 μmol/L剂量时可显著抑制HG诱导的系膜细胞增殖及NF-κB通路的激活,并且良好的抑制MCP-1的分泌和PTX3的表达,对延缓DN的发展,保护肾脏具有一定的作用．