平消胶囊联合紫杉醇对小鼠黑色素瘤生长与转移的抑制作用

李芳芳,管道坤,郭梦琦,任倩文,王洪波,田京伟

(烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学), 山东 烟台, 264005)

平消胶囊现收载于2015年版 《中国药典》 第一部成方制剂中, 是《肿瘤姑息治疗中成药使用专家共识 (2013版) 》重点推荐抑瘤类中成药[1]. 平消胶囊由东汉张仲景所著《金匮要略》中的 “硝石矾石散” 化裁而成, 组方中含有郁金、仙鹤草、马钱子、白矾、硝石、五灵脂、干漆和枳壳, 具有活血化瘀、清热解毒和止痛祛邪等功效[2]. 药典标识的功能与主治为活血化瘀,止痛散结, 清热解毒[3].

近年来, 癌症的中西医结合疗法受到社会广泛关注,中医药的作用在抗肿瘤方面日益突显[4]. 抑瘤类中成药可作为肿瘤治疗的辅助用药, 减轻放化疗引起的毒副作用, 在临床上常与标准的化疗方案联合使用[5]. 临床研究显示平消胶囊联合索拉非尼可提高中晚期老年肝癌患者化疗的临床疗效[6], 平消胶囊联合大肠癌FOLFOX4方案可显著提高癌术后患者的生存质量[7]. 平消胶囊对于肺癌有着广泛的适应症和独特的优势, 尤其对肺癌放化疗有着明显的减毒增效作用, 对延长患者的生存期、改善患者的生存质量、降低复发和远处转移率具有重要的临床意义和广泛的应用前景[8-9].

紫杉醇 (Paclitaxel, PTX) 是一种广谱抗肿瘤药,对多种恶性肿瘤显示出肯定的临床效果,也是晚期黑色素瘤一线治疗的备选方案之一．紫杉醇属于有丝分裂抑制剂, 通过促进微管蛋白聚合、抑制解聚、保持微管蛋白稳定、抑制细胞有丝分裂和促进肿瘤细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用[10-11]. 紫杉醇被美国FDA批准上市的第一个适应症为晚期卵巢癌, 临床应用中紫杉醇对其他实体瘤, 如肺癌、乳腺癌等也显示出良好的治疗效果[12]. 平消胶囊与紫杉醇联合应用的临床研究较少, 亦未发现临床前的实验研究. 为了更好地指导临床用药, 研究平消胶囊对紫杉醇抗肿瘤活性的影响, 本文建立了小鼠黑色素瘤 (B16) 皮下异体移植模型和肺转移模型, 探索平消胶囊和紫杉醇联用的抗肿瘤作用, 并对其作用机制进行了初步研究, 旨在为临床合理用药提供参考.

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

平消胶囊购于西安正大制药有限公司; 紫杉醇注射液购于扬子江药业集团有限公司; 小鼠白细胞介素10 (Interleukin-10, IL-10) 酶联免疫检测试剂盒购自于上海联硕生物科技有限公司; DMEM 高糖培养基、胎牛血清、青霉素及链霉素均购于美国 Gibco 公司; 胰蛋白酶购自上海碧云天生物技术有限公司.

1.2 实验动物

实验所用C57BL/6小鼠 (雄性, 18～20 g) 购于济南朋悦实验动物繁育有限公司. 实验开始前将动物置于12 h∶12 h昼夜交替节律的无特定病原体 (Specefic pathogenfree, SPF) 级标准实验条件下分笼饲养, 预适应至少一周. 所有实验均按照中华人民共和国卫生部和中国医科大学动物保健委员会的指导原则进行. 研究方案经烟台大学实验动物研究委员会批准.

1.3 实验细胞与培养

B16黑色素瘤细胞株由中国医学科学院药物研究所陈晓光教授课题组友情馈赠. B16细胞用含10% 胎牛血清及100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 DMEM 高糖培养基, 于 37 ℃、CO2体积分数为 5% 的细胞培养箱中培养, 2 ～ 3 d传代一次. 取处于对数生长期的细胞进行后续各项实验.

1.4 B16黑色素瘤皮下异体移植瘤模型

1.4.1 模型建立 取生长状态良好的 B16 细胞, 胰蛋白酶消化后用含血清培养基吹打制备单细胞悬液, 1 500 r/min离心5 min, 弃去上清. 加适量生理盐水重悬, 1 500 r/min离心5 min, 弃去上清, 收集细胞, 此过程重复2次, 加生理盐水将细胞密度调整为2×105个/mL. 取0.1 mL细胞悬液接种到小鼠的右侧腋下, 生长2周后将瘤块取出, 剥取适量形态较好的瘤组织称重, 加4倍体积的生理盐水研磨均匀制备瘤液. 将瘤液接种到小鼠的右侧腋下, 每只0.1 mL.

1.4.2 分组及给药 接种后的小鼠随机分为4组, 每组5只, 分别为模型组、平消组、紫杉醇组和联用组 (平消胶囊与紫杉醇). 紫杉醇注射液用无菌生理盐水稀释至给药浓度, 平消胶囊研磨后以CMC-Na混悬. 于造模成功后第2天开始给药: 模型组灌胃给予溶媒 (0.05% CMC-Na), 每日1次; 平消组(250 mg/kg), 灌胃, 每日1次; 紫杉醇组 (30 mg/kg), 腹腔注射, 每周2次; 联用组 (平消胶囊250 mg/kg和紫杉醇30 mg/kg). 实验过程中每2 d记录小鼠的体重变化. 给药2周后脱颈处死小鼠, 将瘤块剥离并称重.

1.5 B16黑色素瘤肺转移模型

1.5.1 模型建立 根据已报道的方法稍加优化[13], 取对数生长期的 B16 细胞, 胰蛋白酶消化后用含血清培养基吹打制备单细胞悬液, 1 500 r/min离心5 min, 弃上清. 加适量生理盐水重悬, 1 500 r/min离心5 min, 弃去上清, 收集细胞, 此过程重复2次. 加生理盐水将细胞密度调整为5×104个/mL, 通过尾静脉注射的方式将细胞悬液注入小鼠体内, 每只0.1 mL.

1.5.2 分组及给药 通过尾静脉注射B16细胞的方式获得模型小鼠共20只, 随机分为4组, 每组5只, 分别为: 模型组, 平消组, 紫杉醇组, 联用组 (平消胶囊与紫杉醇). 连续给药18 d, 给药方案同1.4.2.

1.5.3 小鼠肺组织检查 B16黑色素瘤肺转移模型小鼠于末次给药后脱颈处死, 小心剥离完整肺部组织置于体积分数为4% 的多聚甲醛磷酸缓冲液中固定, 48 h后取出, 进行梯度乙醇脱水, 二甲苯透明, 石蜡包埋后做连续切片, 片厚为4 μm, HE染色法对组织进行染色.

1.5.4 酶联免疫吸附法 (ELASA) 检测小鼠血浆中IL-10含量 B16 黑色素瘤肺转移模型小鼠于末次给药后, 经右眼眶内眦取出全血, 置于事先准备好的肝素离心管中. 3 500 r/min离心10 min, 取上层血清于-20 ℃冰箱中保存待用. 后续各步实验操作均按照上海联硕生物科技有限公司的小鼠IL-10酶联免疫检测试剂盒说明书进行.

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 平消胶囊可增强紫杉醇对B16皮下移植瘤生长的抑制作用

通过B16黑色素瘤皮下异体移植瘤模型研究平消胶囊对紫杉醇抗肿瘤活性的影响. 如图1所示, 与模型组比较, 30 mg/kg的紫杉醇和250 mg/kg的平消胶囊单用均可显著抑制黑色素瘤的生长(P< 0.05, 与模型组相比); 250 mg/kg的平消胶囊可显著增强紫杉醇的抗肿瘤活性 (P< 0.05, 与紫杉醇组相比).

*:P<0.05,与模型组相比;#:P<0.05,与紫杉醇组相比.

图1平消胶囊联合紫杉醇对B16移植瘤生长的影响

Fig.1 The effect of Pingxiao capsule combination with paclitax-el on the xenograft tumor growth of B16

2.2 平消胶囊可缓解紫杉醇引起的小鼠体重下降

实验过程中, 记录小鼠体重并进行分析. 结果如表1所示, 紫杉醇组小鼠的体重明显下降 (P< 0.05, 与模型组相比), 联合平消胶囊后可以部分缓解紫杉醇引起的小鼠体重降低幅度. 平消胶囊与紫杉醇联用组和模型组小鼠相比体重下降但是不具有统计学差异.

表1 小鼠体重变化表

*:P< 0.05, 与模型组相比.

2.3 平消胶囊增强紫杉醇抑制小鼠肺转移的药理作用

给药18 d后脱颈处死小鼠, 小心剥离完整肺组织并拍照. 结果如图2所示, 模型组小鼠肺组织表面布满黑色素瘤细胞. 与模型组相比, 平消胶囊和紫杉醇单用均能抑制黑色素瘤的生长和转移. 其中, 紫杉醇单用组抑瘤效果优于平消单用组. 平消胶囊与紫杉醇联用组小鼠肺组织表面的黑色素瘤体数量明显减少, 呈点状分布, 显示两药联用对黑色素瘤生长的抑制作用更加明显.

HE染色法观察小鼠肺组织黑色素瘤细胞的转移情况, 在200×显微镜下观察小鼠肺组织的病理变化. 结果如图3所示, 图3中黑色箭头代表B16肿瘤的转移灶, 模型组 (图3(a)) 肺组织中可见大量黑色转移灶, 平消组 (图3(b)) 与模型组相比转移灶有所减少. 紫杉醇组 (图3(c)) 与模型组相比转移灶数量进一步减少, 且肿瘤面积小于平消单用组. 平消胶囊与紫杉醇联用 (图3(d)) 可明显减少B16的肺部转移灶, 有效抑制黑色素瘤的生长和转移, 并且效果较两药单用为优.

图2平消胶囊联合紫杉醇对小鼠肺组织B16瘤体生长的影响

Fig.2EffectofPingxiaocapsdecominedwithpoclrtacelonthegrowthofmetastatectumorofB16

图3平消胶囊联合紫杉醇对B16肺转移的HE染色结果(×200)

Fig.3 HE stainning result of Pingxiao capsule combination with paclitaxel on the metastatic tumor of B16(×200)

2.4 平消胶囊联合紫杉醇可降低小鼠血清中IL-10的含量

酶联免疫吸附法检测小鼠血浆中IL-10. 结果如图4所示, 紫杉醇和平消胶囊单用不能改变小鼠血浆中的IL-10含量, 而250 mg/kg的平消胶囊和30 mg/kg紫杉醇联用可明显降低小鼠血清中IL-10的含量 (P< 0.05,与模型组相比).

图4平消胶囊联合紫杉醇对动物血清中IL-10的影响

Fig.4 Effect of Pingxiao capsule combination with paclitaxel on the serum content of IL-10

3 讨 论

在各类皮肤肿瘤中, 黑色素瘤恶性程度最高, 发展迅速, 危害人民健康[14].平消胶囊目前已广泛用于多种恶性肿瘤的协同治疗, 可提高放化疗疗效, 降低不良反应, 提高患者生存质量, 但目前尚未有平消胶囊用于治疗黑色素瘤的实验研究．蔡邵朋等发现,平消胶囊联合索拉菲尼可提高中晚期原发性肝癌患者的近期临床疗效,显著提高免疫功能恢复,抑制VEGF表达[15]; 房芳等研究发现平消胶囊联合吉非替尼可提高中晚期非小细胞肺癌治疗效果, 毒副反应小[16]. 本研究旨在探索平消胶囊与紫杉醇联用抑制小鼠黑色素瘤生长与转移的作用.

本研究首先建立了C57BL/6小鼠B16皮下异体移植瘤模型探索平消胶囊联合紫杉醇对小鼠黑色素瘤生长的抑制作用. 研究发现,与模型组相比, 250 mg/kg的平消胶囊和30 mg/kg的紫杉醇单用均能显著抑制B16瘤体的生长, 抑瘤率分别为25.66%和32.88%, 而两者联合应用抗肿瘤作用增强, 抑瘤率高达62.54%, 肿瘤明显减小. 随后, 通过建立B16黑色素瘤小鼠肺转移模型, 进一步研究了平消胶囊单用及平消胶囊与紫杉醇联用对B16黑色素瘤细胞肺转移的影响. 通过对小鼠肺组织的显微病理检查发现, 平消胶囊和紫杉醇单用均能明显抑制肿瘤细胞的增殖和转移; 与紫杉醇和平消胶囊单用组相比, 平消胶囊联合紫衫醇可进一步增强抗肿瘤效果. 同时, 基于小鼠体重变化值可知, 平消胶囊可缓解紫杉醇引起的小鼠体重下降, 这表明平消胶囊可部分缓解紫杉醇的毒副反应.

肿瘤细胞本身可主动分泌抑制性细胞因子, 如VEGF、TGF-β及Th2型细胞因子IL-10、IL-6、IL-4等, 用以调节局部免疫细胞的功能. 白细胞介素-10 (Interleukin-10, IL-10) 主要由Th2细胞、单核巨噬细胞和活化B细胞等免疫细胞产生, 可以抑制TNF-α、IL-1、IL-12和IFN-Y等多种细胞因子的分泌[17-19]. IL-10 是一个多功能的细胞因子,具有免疫抑制和血管生成的作用. IL-10对多种免疫细胞如巨噬细胞、Th1细胞、NK细胞等的活性具有抑制作用, 因此IL-10可能和肿瘤的免疫逃逸密切相关[19]. 有研究表明在转移灶中IL-10高于原发肿瘤, 提示IL-10促进肿瘤转移. IL-10也能活化抑制性T细胞, 从而形成免疫抑制环境, 进而诱导肿瘤免疫逃逸[20]. 国外研究发现, 弥漫大B细胞淋巴瘤患者血清中IL-6, IL-8和IL-10的水平与临床病理特征及预后关系密切[21]; IL-10因子-1082A/G多态性与口腔鳞状细胞癌风险增加密切相关[22]; IL-10 可通过抑制巨噬细胞功能诱导肿瘤和血管内皮细胞增殖从而促进B16黑色素瘤的生长[23]. 因此本研究通过酶联免疫法检测联合用药对黑色素瘤肺转移模型小鼠血清中IL-10含量的影响. 研究发现, 与模型组相比, 紫杉醇和平消胶囊单用未能有效改变小鼠血清中IL-10的含量, 而紫杉醇和平消胶囊联用后血清中IL-10含量明显下降. 这可能与两者联用后, 通过诱导肿瘤细胞发生凋亡, 释放肿瘤抗原, 并进一步增加肿瘤细胞的免疫原性而促进树突状细胞 (Dendritic cells, DCs) 提呈抗原和T 细胞活化, 从而使肿瘤细胞的免疫抑制作用减弱, 机体免疫力增强有关[24].

另外, 平消胶囊辅助治疗肿瘤可能的相关机制还有:(1)下调VEGF表达, 抑制肿瘤中新生血管的生成[25]; (2) 抑制黏附分子CD44v6表达, 预防癌细胞转移[26]; (3) 改变高黏高凝血流变性和肠系膜微循环[27]; (4) 上调COX相关基因表达[28]; (5) 恢复白细胞低下, 减轻骨髓抑制[29]等. 因为中药成分较多, 各组分互扶互助, 耐药性和毒副反应小, 在肿瘤协同治疗中的优势日益显现. 然而, 也是由于成分复杂, 其对信号传导, 基因表达, 细胞周期及凋亡的作用机制尚不完全明确, 因此, 平消胶囊抗黑色素瘤进一步的作用机制仍是我们未来研究的方向.

4 结 论

综上所述, 平消胶囊和紫杉醇联合用药可增强后者的抗肿瘤作用, 并缓解紫杉醇的副作用, 增效的作用机制可能与降低小鼠外周血中IL-10的含量有关. 因此本研究具有较好的临床用药参考价值, 为两种药物的进一步研究提供一定的理论依据, 也为中西医结合治疗肿瘤提供了新思路.