3种重金属对斑马鱼的联合毒性及迷迭香酸的保护作用研究

宋明霞,陈天荣,钱豪文,许 波

(烟台大学生命科学学院线粒体健康与衰老研究中心,烟台大学,山东 烟台 264005)

水环境是各种污染物的综合受体,其中重金属污染物会在生物体内富集,最终通过食物链富集到人体内,对人体产生致畸、致癌、致突变的作用．城市污水是工业废水和生活污水的混合体,被多种重金属污染的水体会发生复杂的联合毒性效应[1]．

迷迭香酸(Rosmarinic acid)是一种具有多种生物活性的天然水溶性酚类化合物,广泛存在于迷迭香、紫苏、夏枯草、丹参、鼠尾草、薄荷植物中，具有许多药理活性，如抗菌抗病毒、抗炎及免疫调节、保护神经系统、抗辐射抗肿瘤、抗氧化及清除自由基、抑制黄嘌呤氧化酶、保肝护肺等[2-6]．

斑马鱼(Daniorerio)属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio),是生物医学和毒理学模型的最佳的模式生物之一[7-11]．本实验以斑马鱼作为实验动物,探索多种重金属联合诱导斑马鱼发育毒性特性,研究天然抗氧化剂迷迭香酸对重金属致斑马鱼胚胎细胞凋亡的保护作用．

1 材料与方法

1.1 实验动物

AB系斑马鱼由北京大学张博教授惠赠,由本实验室繁育保种,成年斑马鱼饲养于独立养殖单元(北京爱生),水温28.5±0.5 ℃,盐度450～500 μS,pH值 7.0,光照周期为14 h/10 h(明/暗)交替循环．每日早晚各饲喂一次新鲜孵化的丰年虾．收集的卵置于平板培养皿中,去除死卵、粪便和其他杂物,用E3(0.17 mol/L KCl,5 mmol/L NaCl,0.33 mmol/L MgSO4,0.33 mmol/L CaCl2,pH值7.4)洗涤数次,转移到28.5 ℃恒温培养箱中培养,及时移除未受精和死卵并换水,未受精的卵或死卵呈白色,正常胚胎呈透明状．

1.2 实验药品

NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、CdCl2、CuSO4购自天津瑞金特;Pb(NO3)2购自国药集团化学试剂有限公司;0.25 %EDTA胰蛋白酶细胞消化液、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;胶原蛋白酶Ⅱ购自Solarbio;胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司;迷迭香酸(RA)购自Life Technologies,荧光定量试剂盒SYBR®premix Ex TaqTMⅡ、逆转录试剂盒(PrimescriptTM RT reagent kit)均购自Takara公司．

1.3 实验仪器与设备

Step One plus 荧光定量PCR仪为AB公司产品;AE31型荧光倒置显微镜为Motic公司产品;SpectraMax®Paradigm®Multi-Mode Detection Platform型多功能酶标仪为Molecular devices公司产品;SMZ800型体视显微镜为Nikon公司产品;HC-3018R型高速冷冻离心机为安徽中科公司产品;ACAE NovoCyteTM系列流式细胞仪为ACEC Biosciences公司产品;斑马鱼养殖系统为北京爱生产品;体式显微镜为南京江南永新光学有限公司产品;PHS-3C型PH计为上海精密科学仪器有限公司产品;6孔细胞培养板．

1.4 毒性实验

1.4.1 胚胎染毒实验 参照文献[7]方法,收集受精后2 h(2 hpf)斑马鱼胚胎,置于6孔细胞培养板中,30枚/孔．每孔分别加入含有不同测试样品E3溶液3 mL,另设只加E3培养液孔作为正常对照,每处理组设3个平行复孔．将培养板置于28.5 ℃恒温光照培养箱内,每24 h更换新培养液,以卵黄凝结、心跳停止为胚胎死亡终点,记录各组胚胎死亡情况,及时吸掉死亡胚胎．至96 hpf胚胎完全孵化后,观察畸形幼鱼数量并拍照记录．统计24,48,72和96 hpf时的死亡数,计算96 hpf胚胎死亡率．

采用SPSS 20.0统计分析软件进行数据处理分析,建立药物浓度对死亡概率的回归方程．计算出96 hpf的LC50值．

1.4.2 重金属联合毒性实验 根据单一重金属对斑马鱼胚胎毒性试验结果,按照1∶1的混合比例设置Cd2+、Cu2+、Pb2+两两之间联合试验的质量浓度,实验设计采用等毒性配比法,按毒性单位1∶1的比例混合,并对Cd2+、Cu2+、Pb2+的联合毒性进行评价．

1.4.3 RA联合毒性实验 实验分为4个处理组:Control组、Cd2+-Pb2+-Cu2+重金属联合组、60 μmol/L RA与Cd2+-Pb2+-Cu2+重金属联合处理组、60 μmol/L RA组．将培养板置于28.5 ℃恒温光照培养箱内,每24 h更换新测试溶液,并以卵黄凝结、心跳停止做为胚胎死亡终点,记录不同测试组中胚胎死亡数量,及时弃除死亡胚胎．至96 hpf胚胎完全孵化后,体视显微镜下观察幼鱼的畸形数量并拍照记录．计算96 hpf死亡率．

1.5 胚胎凋亡的检测

按照1.4.3的处理方法,将4个实验组的胚胎处理24 hpf后,在解剖镜下将卵膜剥离,0.25 %EDTA胰蛋白酶消化为单个细胞,按照试剂盒使用说明书操作,流式细胞仪检测荧光水平．

1.6 胚胎Bcl-2/Bax、Capases 3基因表达的检测

采用Real time-PCR方法检测斑马鱼胚胎细胞Bcl-2/Bax基因表达水平．引物均购于上海生工生物工程技术服务有限公司．按照1.4.3的处理方法,将4个实验组的胚胎处理至96 hpf后,TRIzol法提取总RNA,A260/A280为1.8～2.0,逆转录为cDNA．

SYBR实时荧光定量PCR法检测各组胚胎基因表达情况,基因表达的相对定量用比较Ct值法[12],用内参基因β-actin来校正差异,变化的倍数为2-ΔΔCt．计算公式为变化倍数=2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)药物处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)Control．PCR反应体系为20 μL:SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、前引1 μL、后引1 μL、模板1 μL、ddH2O 6.6 μL,ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL;反应条件为:预变性,95 ℃, 10 min；变性,95 ℃,15 s；退火,60 ℃,1 min,重复40个循环．

1.7 数据统计与分析

用SPSS 20.0软件求出平均死亡率(换算成概率单位)与实验用水的重金属质量浓度对数回归方程、斑马鱼胚胎96 hpf的半数致死浓度(LC50)和95 %的置信区间．

安全质量浓度由公式SC=96 hpf-LC50×f求出,由于Cd2+、Cu2+、Hg+、Pb2+、Zn2+、Cr3+属难分解、蓄积性强、毒性较大的物质,本实验f值取0.01[13];运用Origin 8.0对斑马鱼胚胎死亡数据作图．

联合毒性按S=(Am/A)+(Bm/B)公式计算,S为联合毒性,A、B为单一毒性的LC50值,Am、Bm为混合毒性的LC50值．联合毒性按Marking的相加指数法[14]评价,相加指数AI=(1/S)-1(当S≤1时);AI=S×(-1)+1(当S>1时);用AI判断联合毒性,当AI=0时,为毒性相加作用;当AI<0时为拮抗作用;当AI>0时为协同作用．

2 结果与分析

2.1 急性毒性实验结果

2.1.1 单一重金属急性毒性实验 Cd2+、Cu2+、Pb2+3种重金属对斑马鱼的毒性的回归分析见表1,Cd2+、Cu2+、Pb2+对斑马鱼胚胎的毒性96 hpf-LC50分别为26.11、3.755、271.984 mg/L,安全浓度分别为261.1、37.55、2 719.84 μg/L．

表1 Cd2+、Cu2+和Pb2+对斑马鱼胚胎毒性实验数据的回归分析结果

2.1.2 重金属Cd2+-Pb2+的联合急性毒性实验 对联合毒性的概率单位-浓度对数值进行线性回归分析(表2),Cd2+和Pb2+共存时对斑马鱼胚胎96 hpf-LC50分别为16.534 mg/L、89.997 mg/L,计算可得，AI为0.037,其联合毒性表现为协同作用,Cd2+和Pb2+的联合毒性大于单一的Cd2+或Pb2+的毒性．

表2 Cd2+和Pb2+对斑马鱼胚胎联合作用实验数据的回归分析结果

2.1.3 重金属Cd2+-Cu2+的联合急性毒性实验 对联合毒性的概率单位-浓度对数值进行线性回归分析(表3),Cd2+和Cu2+共存时对斑马鱼胚胎96 hpf-LC50分别为13.808 mg/L和1.065 mg/L,计算可得，AI为0.114,其联合毒性表现为协同作用,Cd2+和Cu2+联合毒性大于单一的Cd2+或Cu2+的毒性．

表3 Cd2+和Cu2+对斑马鱼胚胎联合作用实验数据的回归分析结果

2.1.4 重金属Cu2+-Pb2+的联合急性毒性实验 对联合毒性的概率单位-浓度对数值进行线性回归分析(表4),Cu2+和Pb2+共存时对斑马鱼胚胎96 hpf-LC50分别为2.735 mg/L、113.805 mg/L,计算可得，AI为-0.366,其联合毒性表现为拮抗作用,Cu2+和Pb2+联合毒性大于单一的Cu2+或Pb2+的毒性．

表4 Cu2+和Pb2+对斑马鱼胚胎联合作用实验数据的回归分析结果

2.1.5 重金属Cd2+-Pb2+-Cu2+的联合急性毒性实验 对联合毒性的概率单位-浓度对数值进行线性回归分析(表5),Cd2+、Cu2+和Pb2+共存时对斑马鱼胚胎96 hpf-LC50分别为13.470 mg/L、3.551 mg/L、40.410 mg/L,计算可得AI为0.005,其联合毒性表现为协同作用．

表5 Cd2+、Pb2+和Cu2+对斑马鱼胚胎联合作用实验数据的回归分析结果

2.1.6 RA与重金属Cd2+-Pb2+-Cu2+联合的胚胎发育毒性实验 如图1所示，与空白对照组相比,Cd2+-Pb2+-Cu2+处理组对斑马鱼胚胎有明显的致死效应(P<0.01)，且胚胎死亡均发生于24 hpf之内．与 Cd2+-Pb2+-Cu2+处理组相比,60 μmol/L的RA与Cd2+-Pb2+-Cu2+联合处理斑马鱼胚胎死亡率显著下降(P<0.01);60 μmol/L的RA单独处理组对斑马鱼胚胎死亡率无影响(P>0.05)．

图1迷迭香酸联合Cd2+-Pb2+-Cu2+暴露96 h对斑马鱼胚胎发育的毒性影响

Fig.1ToxiceffectsofresveratrolcombinedwithCd2+-Pb2+-Cu2+onzebrafishembryosdevelpment

2.2 RA与重金属Cd2+-Pb2+-Cu2+联合致胚胎凋亡结果

由流式细胞仪检测结果可知(图2),与空白对照组相比，Cd2+-Pb2+-Cu2+处理组中斑马鱼胚胎细胞凋亡率显著上升(P<0.01),与Cd2+-Pb2+-Cu2+处理组相比,60 μmol/L 的RA联合Cd2+-Pb2+-Cu2+处理组斑马鱼胚胎细胞,细胞凋亡率明显下降．

2.3 RA与重金属Cd2+-Pb2+-Cu2+联合致胚胎Bcl-2/Bax、Caspase 3基因表达结果

由PCR检测结果可知(图3和图4),与空白对照组比较,Cd2+-Pb2+-Cu2+重金属联合处理斑马鱼胚胎组像中Bcl-2/Bax比值降低,Caspase3基因表达上调(P<0.05);与Cd2+-Pb2+-Cu2+重金属处理组相比,采用60 μmol RA与Cd2+-Pb2+-Cu2+重金属联合处理斑马鱼,胚胎组织中Bcl-2/Bax比值升高,Caspase3基因表达下调(P<0.05)．

3 结 论

Cd2+,Pb2+,Cu2+单独及联合作用均对斑马鱼胚胎发育具有明显的毒性效应,导致斑马鱼胚胎发育阻滞、心脏水肿、卵黄囊水肿、脊柱弯曲、胚胎体型发育短小等多种发育异常,在3种重金属联合处理下,胚胎细胞凋亡率明显上升．与Cd2+-Pb2+-Cu2+处理组相比,迷迭香酸与Cd2+-Pb2+-Cu2+联合处理组的斑马鱼胚胎死亡率明显降低(P<0.01)，凋亡细胞数量明显减少，Bcl-2/Bax比值升高(P<0.01),Caspase3基因表达下调(P<0.05),说明迷迭香酸对Cd2+-Pb2+-Cu2+引起的胚胎发育毒性具有明显的保护作用，通过改善氧化协迫状态，上调Bcl-2/Bax和下调Caspase3基因表达,从而对Cd2+-Pb2+-Cu2+所引发的细胞凋亡起到抑制作用．

图3迷迭香酸联合Cd2+-Pb2+-Cu2+对斑马鱼胚胎Bcl-2/Bax基因表达的影响

Fig.3RosemaryacidjointCd2+-Pb2+-Cu2+effectonzebrafishembryosBcl-2/Baxgeneexpression

图4迷迭香酸联合Cd2+-Pb2+-Cu2+对斑马鱼胚胎Caspase3基因表达的影响

Fig.4RosemaryacidjointCd2+-Pb2+-Cu2+effectonzebrafishembryosCaspase3geneexpression