TJ-5 抑制ubch5c 介导NEMO 泛素化调控NF-κB 通路对MHD 患者体内微炎症的影响

姚书东 吴 佳 罗文荣

维持性血液透析（maintenance hemodialysis，MHD）是终末期肾衰竭（ESRD）患者主要的治疗手段[1]。在肾衰竭患者中普遍存在炎症状态，血液透析患者的不良后果部分归因于该人群中普遍存在的炎症状态，并且相互影响，造成患者病症加重及死亡[2]。近年来，虽然血液透析技术不断更新，但最佳治疗方案尚不确定，且需要长期持续治疗，给患者及其家庭带来持续性的经济负担[3]。本研究探讨倍半萜内酯化合物TJ-5 对维持性血液透析患者微炎症因子的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018 年2 月—2019 年2 月浙江中医药大学附属湖州中医院收治的选择采用自体动静脉内瘘为血管通路的维持性血液透析患者60例，所选患者均无心脏病史，无明显心衰表现，为首次行动静脉内瘘术。所有患者均给予常规降压、纠正贫血等治疗，透析液流量500mL/min，透析血流速200～300mL/min，钙离子浓度1.5mmol/L，抗凝药物为肝素钠，使用低分子肝素抗凝，1 个月内治疗方案固定，未行常规血液透析以外的血液净化治疗，每周2～3 次，每次4～4.5h。另选择我院体检中心健康体检者20 名作为健康对照组。本研究经医院伦理委员会审核通过，患者或家属均签署知情同意书。

1.2 纳入标准（1）参照2006 年美国肾脏病基金会制定的肾脏病生存质量指导指南（III.NKF-K/DOQI）[4]临床明确诊断为终末期肾衰竭患者；（2）所有患者血清肌酐水平均＞707μmol/L，肾小球滤过率＜10%，符合尿毒症的诊断标准[5]；（3）符合维持性血液透析诊断标准者且采用自体动静脉内瘘为血管通路；（4）接受常规血液透析治疗，患者临床情况稳定，非透析时间血压＞90/60mmHg（1mmHg=0.133kPa），透析龄＞3 个月；（5）无明显肺部感染，血管通路感染。

1.3 排除标准（1）不符合诊断标准者；（2）维持性血液透析采用带隧道带涤纶套导管（TCC）及人工移植血管为血管通路；（3）MHD 治疗＜3 个月；（4）临床资料不全，失访；（5）伴随有严重感染，严重心、肺、肝脏疾病，心力衰竭、厌食症以及恶性肿瘤患者；（6）因其他各种原因疗程未结束退出试验或死亡的病例；（7）疗程中更换血液透析方式或透析器类型。

1.4 标本采集 透析结束后，清晨空腹留取受试者静脉血，分别分离MHD 患者和健康志愿者外周血单一核细胞（PBMC），T 细胞分选试剂盒分离纯化得到CD4+T 细胞，并进行鉴定。CD4+T 细胞使用不同浓度TJ-5 处理，将60 例MHD 患者血样本分离纯化得到的CD4+T 细胞分为空白组（0μM/mL TJ-5 处理）和高、低浓度组（10、5μM/mL TJ-5 处理），每组20 份，健康对照组20 份。

1.5 仪器及试剂 ELISA 试剂盒，批号kl-deim-05399，上海柯雷生物科技有限公司；细胞培养箱，型号：BC-J80/160S，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；流式细胞仪，型号：CytoFLEX LX，美国贝克曼库尔特；蛋白印迹仪，型号：PROFIBLOT 48，帝肯（上海）贸易有限公司；移液枪（移液器套装）；RPMI-1640 培养基，批号507767，GIBCO 公司；胎牛血清，批号11011-8613，杭州亿枫生物公司。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 流式细胞术检测MHD 患者外周血Th17/Treg比例 取清晨空腹留取受试者静脉血，采用流式细胞仪检测受试者外周血单核细胞Th17/Treg 比例，取受试者静脉血分离单个核细胞，洗涤，离心后，分别加 入CD25-PE 抗 体、CD4-FITC 抗 体、CD127-PECY5 抗体及CD3-eFluor 660、CD8-FITC 抗体，避光、孵育、洗涤、离心，0.1%多聚甲醛固定液150μL 重悬细胞，使用流式细胞仪射门检测，分选分析CD4+、CD25+、CD127low Treg 和CD3+、CD8-、IL17+TH17细胞比例。流式细胞仪按操作说明检测，数据使用FlowJo 软件分析。

1.6.2 ELISA 法检测MHD 患者外周血CD4+T 细胞经TJ-5 处理后TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10 表达水平 按各研究分组，裂解外周血CD4+T 细胞，试剂盒平衡至室温（20～25℃）后，具体操作按ELISA 试剂盒说明书进行实验，读出OD450 值，计算外周血CD4+T 细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）及白介素-10（IL-10）水平。检测3 次，取平均值计算结果。

1.6.3 Western Blot 法检测MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 细胞P65、I-κB 及磷酸化P65、磷酸化I-κB 蛋白含量 裂解细胞后，提取细胞蛋白，进行SDS-PAGE 电泳，凝胶转膜加一抗、二抗进行免疫反应。按说明书进行具体操作，测定外周血CD4+T 细胞核转录因子（P65）及磷酸化P65（p-P65）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，I-κB）及磷酸化I-κB（p-I-κB）蛋白含量，设置内参β actin 蛋白，进行分析。检测3次，取平均值计算结果。

1.6.4 体外泛素化实验检测泛素连接酶（ubch5c）活性变化 参考文献[4]的方法，裂解细胞后，取上清液，采用镍柱亲和纯化获得目的蛋白ubch5c，透析保存ubch5c，并检测ubch5c 的纯度，通过体外泛素化实验检测泛素连接酶ubch5c 活性变化情况。

1.6.5 免疫共沉淀法检测NF-κB 必须调节蛋白（NEMO）线性泛素化 裂解CD4+T 细胞，离心等到蛋白后，加入anti-NEMO 抗体进行免疫共沉淀，根据Western Blot 法，加一抗anti-linear polyuiquitin 抗体进行免疫印迹，加anti-rabbit 荧光二抗后，用Odyssey检测条带，观察NEMO 发生线性泛素化的情况[5]。

1.7 统计学方法 每个反应体系一式三份作为平行重复。实验结束后，采用2-ΔΔCT 法计算待测目的基因的相对表达量。应用SPSS 22.0 统计软件处理数据，数据以均数±标准差（）表示，两组均数采用t检验，多组数据进行单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 MHD 组60 例，男34 例，女26 例，年龄（52.50±7.61）岁，其中慢性肾小球肾炎33 例，高血压肾损害12 例，糖尿病肾病9 例，梗阻性肾病4 例，多囊肾2 例；血液透析时间均＞3 个月。健康对照组20 名，男11 名，女9 名，年龄（51.2±4.9）岁，血常规白细胞计数4～12×109，淋巴细胞及单核细胞比例正常，均有详细病史，体格检查、心电图、胸部透视等检查均无异常发现，无急慢性感染、高血压、肝肾脏疾病、恶性肿瘤等疾病。两组性别、年龄等比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 MHD 患者与健康志愿者外周血Th17/Treg 比例比较 与健康对照组比较，MHD 患者外周血Th17、Treg 水平增高，单核巨噬Th17/Treg 比例显著上升（P均＜0.05）。见表1、图1。

表1 MHD 患者与健康志愿者外周血Th17/Treg比例比较（%，）

表1 MHD 患者与健康志愿者外周血Th17/Treg比例比较（%，）

注：MHD 为维持性血液透析；Th17 为辅助性T 细胞17；Treg 为调节性T 细胞；与健康对照组比较，aP＜0.05

图1 MHD 患者与健康志愿者外周血Th17 及Treg 比例

2.3 各组MHD 患者外周血TNF-α、Th17、IL-6、IL-10 及TFG-α 因子表达 与低浓度组比较，高浓度组TNF-α、IL-1β、IL-6 明显下调（P 均<0.05），IL-10 明显上调（P<0.05）；高、低浓度组TNF-α、IL-1β、IL-6表达量低于空白组，高于健康对照组，差异有统计学意义（P 均<0.05）；IL-10 表达量高于空白组和健康对照组（P 均<0.05）。见表2。

表2 各组MHD 患者与健康志愿者外周血CD 4+T 细胞炎性因子蛋白表达量比较（）

表2 各组MHD 患者与健康志愿者外周血CD 4+T 细胞炎性因子蛋白表达量比较（）

注：健康对照组为健康志愿者；空白组为0μM/mL TJ-5；低浓度组为5μM/mL TJ-5；高浓度组为10μM/mL TJ-5；MHD 为维持性血液透析；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-1β 为白介素-1β；IL-6 为白介素-6；IL-10 为白介素-10；与低浓度组比较，aP＜0.05；与空白组和健康对照组比较，bP＜0.05

2.4 各组MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 细胞p65 和I-κB 表达及其磷酸化 与低浓度组比较，高浓度组CD4+T 细胞p65 蛋白表达及p-p65 明显下调（P<0.05），I-κB 蛋白表达上调（P<0.05），p-I-κB明显下调（P<0.05）；高、低浓度组p65 蛋白表达及pp65 低于空白组，高于健康对照组（P 均<0.05）；I-κB蛋白表达高于空白组，低于健康对照组（P 均<0.05），p-I-κB 低于空白组，高于健康对照组（P 均<0.05）。见表3、图2。

表3 各组MHD 患者与健康志愿者外周血CD4+T 细胞p65和I-κB 表达及其磷酸化比较（）

表3 各组MHD 患者与健康志愿者外周血CD4+T 细胞p65和I-κB 表达及其磷酸化比较（）

注：健康对照组为健康志愿者；空白组为0μM/mL TJ-5；低浓度组为5μM/mL TJ-5；高浓度组为10μM/mL TJ-5；MHD 为维持性血液透析；p65 为转录因子NF-kB 成员之一；p-p65 为磷酸化p65；I-κB 为核因子κB 的抑制蛋白；p-I-κB 为磷酸化核因子κB 抑制蛋白；与低浓度组比较，aP＜0.05；与空白组和健康对照组比较，bP＜0.05

图2 MHD 患者与健康志愿者外周血CD4+T 细胞p65 和I-κB 表达及其磷酸化

2.5 各组MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 细胞ubch5c 活性抑制率比较 TJ-5 高浓度组CD4+T细胞ubch5c 活性抑制率明显高于低浓度组、空白组和健康对照组（P 均<0.05）。见表4、图3。

2.6 各组MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 细胞NEMO 泛素化率比较 与低浓度组比较，高浓度组CD4+T 细胞NEMO 泛素化率明显下调（P 均<0.05）；高、低浓度组CD4+T 细胞NEMO 泛素化率低于空白组，高于健康对照组（P 均<0.05）。见表5、图4。

表4 各组MHD 患者和健康对照志愿者外周血CD4+T 细胞ubch5c 活性抑制率比较（%，）

表4 各组MHD 患者和健康对照志愿者外周血CD4+T 细胞ubch5c 活性抑制率比较（%，）

注：健康对照组为健康志愿者；空白组为0μM/mL TJ-5；低浓度组为5μM/mL TJ-5；高浓度组为10μM/mL TJ-5；MHD 为维持性血液透析；与低浓度组比较，aP＜0.05；与空白组和健康对照组比较，bP＜0.05

图3 MHD 患者与健康志愿者外周血CD4+T 细胞ubch5c 活性变化

表5 各组MHD 患者和健康对照志愿者外周血CD4+T 细胞NEMO 泛素化率比较（%，）

表5 各组MHD 患者和健康对照志愿者外周血CD4+T 细胞NEMO 泛素化率比较（%，）

注：健康对照组为健康志愿者；空白组为0μM/mL TJ-5；低浓度组为5μM/mL TJ-5；高浓度组为10μM/mL TJ-5；MHD 为维持性血液透析；NEMO 为NF-κB必须调节蛋白；与低浓度组比较，aP＜0.05；与空白组和健康对照组比较，bP＜0.05

图4 MHD 患者与健康志愿者外周血CD4+T 细胞NEMO 线性泛素化

3 讨论

微炎症状态是指人机体在各种内毒素、免疫复合物等刺激下，单核巨噬细胞系统被激活，表达和分泌促炎症细胞因子，缓慢发生并持续存在的免疫性炎症，是导致MHD 患者发生并发症的主要因素，且减弱患者肾功能和透析充分性[6-7]。张伦等[8]研究也表明淋巴细胞比例影响MHD 患者的健康状况。

本实验发现，通过与健康志愿者进行比较，MHD患者外周血Th17、Treg 水平增高，单核巨噬Th17/Treg 显著上升（P 均<0.05），且各炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10 均升高（P 均<0.05）。经过倍半萜内酯化合物TJ-5 处理可有效抑制CD4+T 细胞促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 分泌，并促进抗炎性因子IL-10 上调，减弱免疫性炎症。

当CD4+T 细胞受到外界因素刺激后，I-κB 被磷酸化并降解，激活CD4+T 细胞经典的NF-κB 信号通路，P65 在细胞质和细胞核中可被磷酸化，磷酸化的P65 更容易与特异性启动的靶基因结合促进IL-6、TNFα、IL-1β 等炎性细胞因子转录，并抑制IL-10 等抑炎性细胞因子的转录，发挥协同作用，对于炎症反应的发生发展相当重要[9-10]。实验表明，经过倍半萜内酯化合物TJ-5 处理后，CD4+T 细胞p65 表达及其磷酸化明显下调（P 均<0.05），I-κB 表达上调（P<0.05），其磷酸化明显下调（P<0.05），CD4+T 细胞NF-κB 信号通路被抑制，但还无法恢复到正常水平。

核因子NF-κB 必需调节剂（NEMO）是NF-κB 信号传导中的关键调节因子，通过传递细胞外或细胞内信号，可以控制NF-κB 调节的基因[11-12]。ubch5c 是TNF-α 触发的核因子κB（NF-κB）激活过程中催化NEMO 泛素化的关键泛素酶之一[13-14]。α-santonin 衍生的ubch5c 抑制剂TJ-5 是一种先导化合物，用于炎性和自身免疫疾病的治疗，TJ-5 通过与ubch5c 活性位点Cys85 形成共价加合物而优先结合并灭活ubch5c[15-18]。本研究表明，倍半萜内酯化合物TJ-5 抑制ubch5c 酶活性，减弱NEMO 线性泛素化，调控CD4+T 细胞NF-κB 通路表达分泌IL-6、TNFα、IL-1β 等炎性细胞因子。

倍半萜内酯化合物TJ-5 现主要以体外及动物实验为主，临床研究还较少，对于具体疗效及安全程度尚未知悉，需要更深入研究调查，以望为血液透析患者提供更优质、经济实惠的治疗方案，提高透析患者的生存质量。