白藜芦醇对脓毒症血管舒张功能的保护作用及机制

(陆军军医大学大坪医院野战外科研究所第二研究室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆400042)

脓毒症是临床常见的危重病症，其发生率和病死率均较高。我国每年有300 万脓毒症患者，死于脓毒症者约100 万人。脓毒症休克是指伴有持续性低血压(即给予足量液体复苏仍无法纠正)的严重脓毒症，常伴有低灌注状态或器官功能障碍，其病死率更高[1]。血管功能障碍是脓毒症发生发展过程中的一个重要病理生理过程，是导致组织缺血缺氧，诱发多器官功能障碍、甚至衰竭的重要原因[2]。因此，研究血管功能障碍的防治措施对脓毒症的救治具有重要的意义。

白藜芦醇(resveratrol,Res)是一种多酚类植物抗毒素，是天然的抗氧化物和自由基清除剂，主要存在于各种红葡萄果实和红葡萄酒中[3]。研究表明，Res能够改善脓毒症大鼠血管内皮的损伤，从而减轻血管内皮渗漏[4-5]。但目前，Res对脓毒症血管反应性的作用及其机制探讨较少。本研究利用脓毒症大鼠休克模型，研究Res对脓毒症大鼠血管舒张功能的保护作用，以及对其血流动力学、组织器官灌注及存活率的影响，进一步研究eNOS和iNOS在Res调节血管舒张反应性中的作用，为脓毒症的救治提供新的措施。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

SPF级SD大鼠32只，12～14周龄，雌雄各半，体质量(200±20)g，由陆军军医大学大坪医院实验动物中心提供；白藜芦醇(resveratrol，Res)购自美国Sigma公司，eNOS、iNOS抗体购自美国Abcam公司。

1.2 脓毒症模型的制备

SD大鼠术前禁食12 h，自由饮水，戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，无菌条件下开腹暴露盲肠，将粪便集中至盲肠末端，距末端约0.6 cm处用无菌线结扎，用锥形器在盲肠末端贯通穿刺，将盲肠复位后逐层缝合伤口，腹腔注射生理盐水5 mL，放回笼中正常饲养。观察大鼠平均动脉压(mean arterial blood pressure，MAP)，当MAP下降30%或以上，建模成功，本实验模型成功率为90%以上。

1.3 实验方案

将32只SD大鼠随机分为4组:正常对照组(Sham组)、脓毒症组(Sep组)、常规治疗组(CT组)、Res(10 mg/kg)治疗组(Res组)，每组8只。CT组大鼠给予乳酸林格尔液体35 mL/kg复苏，同时予以血管活性药物多巴胺1.75 mg/kg及头孢呋辛钠100 mg /kg，使MAP大于70 mmHg，中心静脉压维持在8 mmHg。Res组在模型后尾静脉立即给予10 mg/kg Res，12 h后行常规治疗并再次给予相同剂量Res。观察复苏后4组肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA)舒张反应性、动静脉流速、血流动力学(采用八道生理记录仪记录)、肝肾血流量、肠系膜上动脉eNOS和iNOS的表达。另取一批大鼠进行实验，每组16只，观察复苏后72 h大鼠的存活时间和存活率。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 离体肠系膜血管舒张反应的测定 将SMA血管环挂于注有10 mL Krebs-Henseleit液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.03 mmol/L、MgSO4·7H2O 0.45 mmol/L、葡萄糖11.1 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、pH 7.4)的离体器官灌流槽浴槽中，持续充入含95%O2和5%CO2混合气体，分别给予SMA血管环初张力2.0 g，37 ℃恒温孵育约100 min，每20 min换液1次，待张力曲线平稳后，使用NE(10-5mol/L)预收缩后测定血管环对梯度浓度Ach(10-9～10-5mol/L)的舒张性，以张力/血管环重量(g/mg)为量化标准制作浓度-张力曲线，用血管环对Ach的最大舒张反应及浓度-张力曲线评价血管舒张反应性。

1.4.2 肠系膜微血管动静脉流速的测定 大鼠麻醉后，剪去腹部毛发，沿腹部正中剖开2～3 cm的切口，腹腔中加入37 ℃的生理盐水，并暴露盲肠。将大鼠仰卧于观察板上,轻轻提出小肠，并将小肠展放在有观察孔的观察板上，在表面连续滴加37 ℃生理盐水保持温度和湿度。

选取直径为30～50 μm，200 μm长无分支，无明显弯曲的肠系膜微血管，通过连接在显微镜上的超敏感摄像机(HAMAMATSU,C11440)进行观察。在10 min基础观察结束后，以1 000幅/秒的速度，记录微动静脉的流速。用Image-Pro Plus 5.0 software软件测定红细胞流速，以μm/s表示大鼠肠系膜微动脉和微静脉的血流速度。

1.4.3 肝肾血流量的测定 将各组大鼠的肝和肾暴露在激光多普勒成像仪器下(PeriCam PSI ZR，Sweden)，距离为14 cm。利用彩色图像来表示特定部位的相对灌注水平，通过软件(PIMsoft)分析肝和肾的血容量。

1.4.4 eNOS和iNOS蛋白表达的测定 取各组大鼠复苏后1 h的肠系膜上动脉血管，提取其总蛋白，BCA检测蛋白浓度，取等量蛋白电泳跑胶，然后将目的蛋白转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，孵育一抗eNOS和iNOS (1∶2 000，abcam)和β-actin (1∶5 000， Sigma)，使用山羊抗兔及山羊抗鼠二抗，室温孵育1 h，洗膜液冲洗3次后使用Odyssey Clx红外成像仪扫描成像，条带使用Image J 软件分析，以目的条带平均光密/β-actin平均光密度反映目的蛋白表达量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 白藜芦醇对脓毒症大鼠血管舒张反应性的影响

与Sham组相比，脓毒症后血管舒张反应性明显降低，表现为脓毒症SMA对Ach的舒张反应性由Sham组的100%降低至Sep组的38.5%。常规复苏可轻微改善脓毒症血管舒张反应性，但与Sep组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Res可以显著提高脓毒症大鼠血管舒张反应性，血管舒张反应性达到85.1%，与其他组比较差异有极显著性统计学意义(P<0.01)，见图1。

a：SMA舒张反应性的测定；b：SMA最大舒张率 *：与Sham组比较，P<0.01；#：与CT组比较，P<0.01

图1 Res对脓毒症大鼠肠系膜上动脉血管舒张的变化

2.2 白藜芦醇对脓毒症大鼠肠系膜动静脉流速的影响

与Sham组相比，脓毒症后肠系膜动静脉流速明显降低，表现为肠系膜微血管动、静脉红细胞流速分别降低了73.6%和87.3%，差异具有极显著性统计学意义(P<0.01)；常规治疗可轻微改善脓毒症微血管动静脉流速，但与Sep组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。Res可明显改善脓毒症大鼠肠系膜微血管动静脉流速，与CT组相比，Res组动静脉红细胞流速分别增加26.0%和28.0%，差异有极显著性统计学意义(P<0.01)，见图2。

*：与Sham组比较,P<0.01；#：与CT组比较,P<0.01

2.3 白藜芦醇对脓毒症大鼠肝肾血流量的影响

与Sham组相比，脓毒症后肝肾血流量明显降低，肝血流量降低了77.1%、肾血流量降低了79.8%，差异有极显著性统计学意义(P<0.01)。常规复苏可轻微改善脓毒症大鼠肝、肾血流量。Res可明显改善脓毒症大鼠肝肾血流量，与CT组相比，Res组肝、肾血流量分别增加27.4%和24.6%，差异有极显著性统计学意义(P<0.01)，见图3。

a：肝、肾血流量；b：各组肝、肾血流量的统计 *：与Sham组比较,P<0.01；#：与CT组比较,P<0.01

图3 Res对脓毒症大鼠肝肾血流量的变化

2.4 白藜芦醇对脓毒症大鼠血流动力学的影响

脓毒症后大鼠血流动力学的指标迅速下降，MAP降至(46.9±8.84)mmHg，常规复苏可轻微改善脓毒症大鼠MAP，Res组MAP达到(82.3±13.9)mmHg，Res组可以明显提高脓毒症大鼠MAP，差异有极显著性统计学意义(P<0.01)，见图4a。同样，Res对脓毒症大鼠左室最大收缩压(LVSP)、左室内压最大上升/下降速率(±dp/dt max)也有明显的改善作用(P<0.01)，见图4b～d。

a：MAP；b：LVSP；c、d：±dp/dt max *：与Sham组比较,P<0.01；#：与CT组比较，P<0.01

2.5 Res对脓毒症大鼠肠系膜上动脉eNOS和iNOS蛋白表达的变化

与Sham组相比，脓毒症后肠系膜血管eNOS的表达明显降低，iNOS的表达明显升高，常规复苏对eNOS和iNOS的表达有轻微的改变。Res处理后脓毒症大鼠血管eNOS和iNOS的表达明显改善，表现为eNOS的表达明显升高，iNOS的表达明显降低(图5)。

2.6 白藜芦醇对脓毒症大鼠存活率、存活时间的影响

Sep组大鼠存活率低、存活时间短，72 h存活率、存活时间分别为6.25%(1/16)和6.5 h；常规治疗后可部分改善脓毒症大鼠存活率和存活时间，72 h存活率、存活时间分别为12.5%(2/16)和14 h(P<0.05)；Res可以显著提高脓毒症大鼠的存活率，延长存活时间，72 h存活率增加至62.5%(10/16)，差异有极显著性统计学意义(P<0.01)。

a:Western blot分析；b:各组eNOS和iNOS相对表达量 *：与Sham组比较,P<0.05；#：与CT组比较,P<0.05

图5 大鼠肠系膜血管eNOS和iNOS蛋白表达的变化

3 讨论

在脓毒症和脓毒性休克中，舒张功能不全的患者对液体负荷的反应性差，且其预后也较差[6]。本研究发现，Res对脓毒症大鼠SMA血管舒张反应性具有明显的保护作用，进一步研究发现，Res可以改善脓毒症大鼠的血流动力学进而提高组织灌注量，最终提高脓毒症大鼠的存活率和存活时间。究其机制可能为，Res通过调控血管eNOS和iNOS的表达来改善脓毒症大鼠的血管舒张反应性。

白藜芦醇是广泛存在于葡萄皮、花生等植物中的多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗心血管疾病、抗衰老和调节免疫等多种生物活性[7-10]。有研究发现，Res在多种疾病的发生发展中发挥重要的保护作用，如缺血-再灌注损伤、心肌梗死和糖尿病等[11-13]。有研究证实，Res可以保护脓毒症血管内皮的屏障功能，如通过抑制氧化应激、降低炎症因子水平从而减少脓毒症大鼠所致的急性肺损伤、肝损伤[5,14-15]。而Res对血管反应性的研究很少，Carrizzo等[10]发现，Res可改善高血压患者的血管舒张功能。本研究发现，Res主要通过调节血管eNOS和iNOS的表达从而调节血管舒张功能，实现对整体器官的保护作用。

有研究发现，脓毒症后NO产生过多，iNOS的表达增加，而eNOS的表达降低[16]。同时，转基因动物实验表明，eNOS过表达可降低LPS诱导脓毒症小鼠的高病死率，说明eNOS和iNOS在调节血管功能方面发挥着重要作用[2]。目前研究证实，Res对eNOS和iNOS的表达有调节作用，如：Feng等[3]发现白藜芦醇通过激活eNOS的表达，增加了NO的生物利用率；Youn等[17]发现白藜芦醇可以抑制炎症引起的iNOS增加和NF-κB的激活。本研究也发现，Res可以增加血管eNOS的表达及降低iNOS的表达，最终实现对血管舒张功能的保护作用。但是，Res是如何调控脓毒症后血管eNOS和iNOS水平尚不清楚。有研究证实，Rac-1和HIF-1α在调节eNOS和iNOS的表达中发挥着重要的作用，如：Cho等[18]发现，抑制Rac-1的激活可以增加eNOS，降低iNOS的表达，从而改善大鼠心脏衰竭导致的内皮氧化损伤；Matrone等[19]证实，在大鼠大脑中动脉闭塞的模型中，HIF-1α的激活会介导iNOS表达的增加；Wung等[20]证实，白藜芦醇可以抑制内皮细胞中IACM-1 和Rac-1的表达，从而改善内皮细胞的屏障功能；Yao等[21]的研究也发现，白藜芦醇可以抑制结肠炎中HIF-1α的转录和激活。在脓毒症大鼠的模型中，白藜芦醇是否通过抑制Rac-1和HIF-1α的表达来调节eNOS和iNOS的表达，还有待进一步研究。

综上，白藜芦醇通过改善脓毒症大鼠的血管舒张反应性，从而实现了对整体器官的保护作用。