sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A在稽留流产中的表达及意义

谢素娟，肖 迪2，罗 欣2，张 华2，李俊男2，漆洪波2，周 勤

(1.重庆两江新区第一人民医院妇科，重庆 401121；2.重庆医科大学附属第一医院妇产科，重庆 400042)

稽留流产具有一定的特殊性，也称过期性流产，患者主要临床表现是妊娠20周以前胚胎已经死亡，但仍然滞留在宫腔内不能自然排出[1]。相关数据显示，稽留流产患者人数在逐年上升，其主要和遗传、感染性疾病、免疫功能、内分泌失调以及孕妇年龄有关[2-3]。可溶性FMS样酪氨酸激酶-1(soluble FMS-like tyrosine kinase-1, sFlt-1)是一种血管形成抑制因子，在滋养细胞中高表达，尤其是在滋养细胞的浸润和分化中sFlt-1表达显著增强，sFlt-1异常表达会导致妊娠异常。目前在异位妊娠、稽留流产、早期异常孕育过程中是否存在sFlt-1的异常表达有待研究[4]。胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGF-binding protein 3，IGFBP-3)是胰岛素样生长因子的结合蛋白，在胎儿的正常发育过程中起着重要的调节作用[5]。妊娠相关血浆蛋白A(pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A)具有激活补体的特点，起到免疫抑制作用，避免胎儿遭受母体的排斥，在流产、胚胎发育迟缓以及伴有其他妊娠早期并发症的患者血清中PAPP-A水平显著降低[6]。目前临床关于稽留流产的发病机制尚未明确。本研究通过分析sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A在稽留流产中的表达及意义，探讨稽留流产的原因，以期为其防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2015年6月至2017年6月在重庆市两江新区第一人民医院院接受治疗的稽留流产患者40例纳入稽留流产组；选取早期流产患者40例纳入早期流产组；另外选取进行体检的健康妊娠期产妇20例作为正常组。3组研究对象临床资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(表1)。

表1 3组患者临床资料比较

纳入标准：所有患者均自然受孕；正常组超声检查显示孕囊、胎芽或胎心与孕期相符；稽留流产组患者均符合稽留流产的诊断标准[7]，超声检查显示胎囊无胎芽和胎心，胚胎发育与孕期不相符，胚胎停止发育后2个月不能自然排出；早期流产组患者符合早期流产的诊断标准，即妊娠不足12周，胎儿体质量不足1 000 g。排除标准：染色体、生殖器官、免疫功能异常患者；感染性疾病患者；恶性肿瘤患者；慢性妇科炎症患者。本研究经过我院伦理委员会批准，所有研究对象及其家属均知情，并签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 收集3组研究对象的绒毛组织。在无菌环境下采用负压吸引术将绒毛组织吸出，负压设置为400～500 mmHg。当孕囊吸出后，马上将绒毛组织进行分离，使用无菌生理盐水清洗表面血液，冲洗干净之后使用滤纸将组织上的水分吸干，在冻存管内保存，15 min之内将标本组织在-80 ℃环境下保存，待测。

1.2.2 酶联免疫吸附测定sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A表达 采用50 mmol/L碳酸盐包被缓冲液将抗原进行溶解，浓度为10～20 μg/mL，加入至96孔酶标板中,每孔100 μL，4 ℃过夜保存。第2天舍弃包被液，采用PBST洗涤3次，每孔中加入1%的BSA 150 μL，在37 ℃环境中封闭1 h。之后采用PBST洗涤3次，在每孔中加入100 μL不同倍比稀释度的血清，加入对照样品，37 ℃孵育2 h。采用PBST洗涤5次，加入100 μL,稀释后的HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h。PBST洗涤5次，使用显色剂显色20 min后在酶标仪上读取A405吸收值，从而测定sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A的阳性表达情况。

1.2.3 免疫组化染色处理 将石蜡切片样本放在二甲苯中脱蜡处理10 min，将二甲苯更换后再放置10 min，然后梯度酒精水化；加入蛋白酶修复液，在37 ℃的恒温冰箱中孵化30 min，弃抗原修复液；切片移入湿盒中加入浓度为3%的H2O2，去过氧化物酶封闭，恒温冰箱孵育10 min后采用PBS冲洗；加入适量的山羊血清，在室温环境下封闭30 min；用滤纸将封闭液吸取，加入一抗，放入湿盒，然后再加入二抗，室温孵育1 h，采用PBS冲洗；经过DAB显色处理10 min，能够在显微镜下观察到棕黄色阳性反应，则采用PBS冲洗1 min；使用苏木精复染3 min，然后用浓度为1%的盐酸乙醇分化处理，自来水冲洗1 min后，脱水并封片处理。

1.3 结果判定

每个样本在镜头下随机选择5个视野，视野中IGFBP-3蛋白阳性细胞数及sFlt-1蛋白阳性细胞数小于20%的样本定义为阴性样本，阳性细胞数为20%及以上定义为阳性样本。PAPP-A在胞浆和细胞核中显示为棕黄色颗粒的为阳性细胞，样本中阳性细胞数小于5%为阴性样本，阳性细胞数5%及以上定义为阳性样本。 所有病理切片均由2位以上的经验丰富的医师进行确诊。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A表达

各组免疫组化染色情况见图1。正常组sFlt-1表达水平为(0.50±0.08)，显著低于早期流产组(1.32±0.22)和稽留流产组(1.02±0.10)，差异具有统计学意义(P<0.05)；而稽留流产组患者sFlt-1表达水平也低于早期流产患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。正常组IGFBP-3表达水平为(1.48±0.30)，显著高于早期流产组(0.36±0.06)和稽留流产组(1.06±0.12)，差异具有统计学意义(P<0.05)；稽留流产组患者IGFBP-3表达水平高于早期流产患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。正常组PAPP-A表达水平为(1.45±0.26)，显著高于早期流产组(0.32±0.04)和稽留流产组(1.25±0.20)，差异具有统计学意义(P<0.05)；稽留流产组患者PAPP-A表达水平高于早期流产患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图1 各组sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A表达水平比较(免疫组化 ×200)

*：与正常组比较，P<0.05;#：与早期流产组比较，P<0.05

2.2 sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A在稽留流产中联合检测

sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A三项联合检测的敏感度、准确度高于sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A单一检测，特异度低于sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A单一检测，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A在稽留流产中联合检测(%)

3 讨论

稽留流产形成是因为胚胎在子宫内停止发育，稽留过久会导致凝血功能障碍、胚胎在子宫内壁粘连，增加清宫难度，进而引发患者子宫穿孔等并发症[8-11]。通过有效的方式对稽留流产进行诊断，对患者来说具有重要意义。及时发现胚胎停育可提前终止妊娠，降低并发症发生率[12]。

sFlt-1是一种血管内皮生长因子的特异性受体，通过与VEGF竞争性结合，对信号传递有阻断作用，从而抑制血管形成[13]。sFlt-1在人体中异常表达主要与拮抗血管生成有关。妊娠期sFlt-1主要在胎盘的滋养细胞以及内皮细胞中表达，在滋养细胞植入子宫蜕膜组织过程中起到协助作用[14-15]。有研究指出，正常妊娠时，随着绒毛滋养细胞数量和胎盘体积的增加，sFlt-1表达逐渐升高[16]。在早期妊娠中，sFlt-1表达异常会抑制滋养细胞数量增加，阻碍胎盘形成，导致子宫螺旋小动脉循环出现障碍，胚胎停止发育。本研究显示，稽留流产组患者的sFlt-1表达水平高于正常孕妇，其原因是sFlt-1异常表达，加快了VEGF灭活，导致滋养细胞与蜕膜间的血管形成障碍，最终胚胎停止发育[17]。本研究中早期流产患者sFlt-1表达水平高于稽留流产患者，说明早期流产sFlt-1对VEGF血管的形成抑制作用显著。Martínez-Ruiz等[18]认为，sFlt-1异常升高会对胚胎着床部位的血管形成产生障碍，引发不良妊娠结局，在早期的稽留流产中具有重要的意义。

IGFBP-3主要以复合体的形式参与血液循环，大分子三聚体通过毛细血管屏障具有一定的障碍，在IGFBP-3蛋白分解作用下，会促进复合体释放IGF，有助于IGF通过血管内皮屏障，作用于组织血管[19-20]。IGFBP-3的生成受到促生长素的影响，其水平变化主要和患者的年龄有关。研究显示，在青少年时期，IGFBP-3会达到最大值，女性患者IGFBP-3水平显著高于同龄男性患者，而在肥胖、糖尿病、肝功能异常患者中，IGFBP-3水平较低[21-22]。本研究结果显示，稽留流产组患者的IGFBP-3表达水平高于早期流产患者，低于正常组，说明IGFBP-3在稽留流产过程中具有一定的诊断价值。

PAPP-A是一种大分子糖蛋白，主要由胎盘和蜕膜产生，在妊娠期过程中PAPP-A大量产生，被释放到母体血液中，参与血液循环[23-25]。研究显示，PAPP-A浓度的变化与孕周有关，孕妇的孕期增加，PAPP-A水平不断升高，一直到产后，PAPP-A水平下降，在产后6周血清中基本检测不到PAPP-A[26-27]。Smith等[28]指出，PAPP-A和胎盘的功能以及胎盘的成熟程度有关，在正常妊娠孕妇中PAPP-A水平与胎盘的质量、胎儿的体质量具有正相关性，血清中PAPP-A水平直接反映胚胎的成熟程度，显示胎儿的生长发育情况。本研究显示，稽留流产组患者的PAPP-A表达水平高于早期流产患者，低于正常组。分析其原因为当胎盘绒毛发育出现异常时，滋养细胞功能会降低，PAPP-A水平也逐渐下降，导致患者流产。有学者指出，孕妇血清中的PAPP-A浓度高低在胎儿畸形、高危妊娠诊断中发挥着重要作用[29-30]。

此外，本研究结果发现sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A单一检测对于稽留流产诊断的敏感度为70%～75%，而sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A三项联合检测敏感度达到94.87%，明显高于任何单一检测的诊断效果。同时，sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A单一检测对于稽留流产诊断的准确度为71%～75%，也明显低于sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A三项联合检测的准确度(84.48%)，说明sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A三项联合检测在稽留流产中具有较高的诊断价值。

综上所述，sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A联合检测对稽留流产的诊断价值较高，sFlt-1、IGFBP-3、PAPP-A的异常表达参与了稽留流产的发展，为稽留流产的治疗提供一定的借鉴。