黑洋葱多酚成分提取及抗氧化研究

周宁，宁月宝

(内蒙古科技大学 生命科学与技术学院，内蒙古 包头 014010)

洋葱的营养价值极其丰富，含有丰富的人体所需的维生素及微量元素，还含有各种氨基酸。但是洋葱有辛辣气味，而且大量食用会对人的胃肠造成不适。黑洋葱是将新鲜紫皮洋葱放置在恒温恒湿发酵箱中，经过一定温度调控后，发酵1个月后制成的一种黑洋葱食品[1]。黑洋葱去除了洋葱的刺激性气味，并且提高了其抗氧化能力。在抗癌、抗氧化、抗血栓及抗动脉硬化等老年性退行性疾病方面扮演着重要角色。

植物多酚具有调节免疫力、减少脂肪氧化、清除氧自由基、预防心脑血管疾病、抗氧化[2,3]、防辐射、防癌和延缓机体衰老等多种生理功能，开发天然来源的多酚并将其应用到食品中已经成为研究的热点。我们将洋葱发酵成黑洋葱，使用先进萃取技术提取其有效活性成分，通过一系列试验，验证黑洋葱有效成分的抗氧化功能，为黑洋葱作为保健品及药品提供了理论依据。

1 实验材料

1.1 材料

黑洋葱粉末(黑洋葱粉碎，过60目筛)、紫皮洋葱：购于包头昆都仑区阿尔丁大街和平村农贸市场，洗净切块，在鼓风干燥箱中50 ℃下烘干，过60目筛制成洋葱粉备用。

1.2 实验试剂

福林-酚试剂：上海荔达生物科技有限公司；DPPH：Sigma公司；无水乙醇、无水碳酸钠、没食子酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、水杨酸、亚硫酸铁、双氧水(均为国产分析纯)：包头广元化工公司。

1.3 主要仪器

主要仪器见表1。

表1 主要仪器Table 1 The main instruments

2 实验方法

2.1 提取多酚成分

用参考文献[4]的方法稍作修改，使用微波功率600 W、微波温度60 ℃，准确称取2 g黑洋葱干粉，以体积分数为85%的乙醇溶液作为提取剂，在料液比为1∶30(g/mL)下微波辅助提取2 min。提取液以4000 r/min离心10 min, 取上清液,旋转蒸发,浓缩后得浓缩液，浓缩液在4 ℃下保存备用。

2.2 测定多酚含量

测定多酚含量的方法：用没食子酸为标准品作对照，采用Folin-Ciocalteu(FC)法测定。

2.3 标准曲线的确定

参考文献[4]的方法，以没食子酸质量浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

2.4 提取率的计算

用移液枪准确吸取黑洋葱提取液1.0 mL，放置于10 mL比色管中，在760 nm波长处测定其吸光度，制作标准曲线，并根据标准曲线回归方程计算样品中多酚含量。

式中：C为由线性回归方程计算出样品中多酚的质量浓度mg/mL；V为洋葱提取液的体积，mL；n为稀释倍数；m为洋葱投料量，g。

2.5 抗氧化能力的测定

2.5.1 黑洋葱、紫皮洋葱多酚成分对DPPH自由基的清除力

实验参照参考文献[5-7]的方法稍作修改，准确称取DPPH自由基标准品2 mg，用无水乙醇定容至50 mL。将黑洋葱多酚提取液、紫皮洋葱多酚提取液分别配制成不同浓度的溶液，作为待测样品溶液。在10 mL试管中分别依次加入：1.0 mL蒸馏水和3.0 mL 0.04 mmol/L的DPPH溶液，1.0 mL待测样品溶液和3.0 mL 0.04 mmol/L的DPPH溶液，1.0 mL待测样品溶液和3.0 mL无水乙醇，遮光混匀，待反应稳定后，以无水乙醇为参比，在517 nm处测吸光值；分别记为Ac、Ai和Aj。按下式计算DPPH·清除率。

式中：Ai为1.0 mL蒸馏水和3.0 mL DPPH溶液的吸光度；Aj为1.0 mL样品溶液和3.0 mL DPPH溶液的吸光度；Ac为3.0 mL无水乙醇和1.0 mL样品溶液的吸光度。

2.5.2 黑洋葱、紫皮洋葱多酚成分的总还原力

实验参照参考文献[8]的方法稍作修改，将黑洋葱多酚提取液、紫皮洋葱多酚提取液分别配制成不同浓度的溶液，作为待测样品溶液。准确移取1.0 mL溶液于试管中，分别加入2.5 mL 磷酸缓冲液(0.2 mol/L pH 6.6)和1%的2.5 mL铁氰化钾溶液，混合物在50 ℃水浴中恒温20 min，然后快速冷却，再加入10% 的2.5 mL三氯乙酸溶液，以3000 r/min 离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL 蒸馏水、0.1%的0.5 mL三氯化铁溶液，充分摇匀，静置10 min 后在700 nm 波长下测其吸光度值。取50%乙醇，1.0 mL为空白对照液同以上操作参比调零，用吸光度值表示总还原能力的大小。

2.5.3 黑洋葱、紫皮洋葱多酚成分对羟基自由基的清除作用

实验参照参考文献[9,10]的方法稍作修改，将黑洋葱多酚提取液、紫皮洋葱多酚提取液分别配制成不同浓度的溶液，作为待测样品溶液。依次加入2 mL 3 mmol/L FeSO4、2 mL 3 mmol/L水杨酸和2 mL样品到10 mL 的离心管中，最后加入2 mL 3 mmol/L H2O2启动反应，混合均匀后，37 ℃反应1 h。在510 nm处测吸光度(A1)，考虑到样品本身的吸光值，用2 mL蒸馏水代替H2O2，测定510 nm处的吸光度(A2)，对照组用2 mL蒸馏水代替样品，测定510 nm 处的吸光度(A0)。

式中：A0为不加样品溶液的吸光度；A1为样品溶液的吸光度；A2为样品溶液本底吸光度。

3 实验结果

3.1 没食子酸标准曲线

按实验方法绘制没食子酸标准曲线，见图1。计算得线性回归方程为：y=116.20x+0.0272，R2=0.9928。式中：y为吸光度，x为没食子酸质量浓度，(mg/mL)。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 The standard curve of gallic acid

由图1可知，在0.001～0.005 mg/mL范围内没食子酸质量浓度与其吸光度呈良好的线性关系。

3.2 黑洋葱、紫皮洋葱提取液多酚含量

按照2.4的实验方法进行3次平行实验，结果表明黑洋葱多酚平均含量为25.76 mg/g，紫皮洋葱中多酚平均含量为19.93 mg/g。

3.3 黑洋葱、紫皮洋葱多酚成分对DPPH自由基的清除力

DPPH方法是基于氢原子转移的抗氧化评价方法[11]。DPPH·是一种稳定的自由基，溶于乙醇后呈现紫色，在 517 nm 处具有最大吸收峰。多酚可还原DPPH自由基，将其颜色变浅。抗氧化剂清除DPPH自由基的能力可根据吸光度的变化检测，进而对其抗氧化活性进行评价。按2.5.2的实验方法，测得不同浓度黑洋葱多酚、紫皮洋葱多酚对DPPH自由基的清除能力，见图2。进行显著性差异分析,结果证明黑洋葱与紫皮洋葱多酚成分的DPPH自由基清除力结果P<0.01，有显著性差异，说明紫皮洋葱经发酵成为黑洋葱后DPPH自由基清除能力增强。

图2 黑洋葱和紫皮洋葱对DPPH自由基清除率的对比Fig.2 Comparison of DPPH free radical scavenging rates between black onion and purple onion

3.4 黑洋葱、紫皮洋葱多酚成分的总还原力

多酚类抗氧化物质有送出电子的还原能力，Fe3+的还原反应通常用来表征物质的还原能力。本实验采用铁离子还原法对多酚成分的还原能力进行研究。多酚提取物拥有越强的还原能力,越多的铁离子被还原得到亚铁离子,生成越多的蓝色普鲁士蓝。进而测得在波长700 nm下的吸光度,就可得多酚提取物的还原能力[12]。取黑洋葱多酚提取液、紫皮洋葱多酚提取液分别配制成不同浓度的溶液然后测定总还原力，测定结果见图3，利用SPSS软件对黑洋葱、紫皮洋葱多酚成分总还原力进行测定,结果结果证明黑洋葱与紫皮洋葱多酚成分总还原力结果P<0.05，有差异，说明黑洋葱及紫皮洋葱均具有较强的总还原力，并随着浓度的增加，总还原力随之增加，并且黑洋葱总还原力大于紫皮洋葱。

图3 黑洋葱和紫皮洋葱多酚成分的总还原力对比Fig.3 Comparison of total reducing capacity of polyphenols from black onion and purple onion

3.5 黑洋葱、紫皮洋葱多酚成分对羟基自由基的清除作用

细胞膜中的不饱和脂肪酸脂质可因为H2O2引发细胞膜损坏、过氧化反应;还能促使DNA链断裂,诱发细胞衰亡,从而使细胞损伤,多种病理机制都有参与[13]。且H2O2具有强氧化性,所以多酚拥有越强的H2O2清除力,则说明多酚抗氧化性越强。取黑洋葱多酚提取液，将紫皮洋葱多酚提取液分别配制成不同浓度的溶液，然后测定对羟基自由基的清除作用，测定结果见图4。

图4 黑洋葱和紫皮洋葱对羟基自由基清除作用的对比Fig.4 Comparison of scavenging effect of black onion and purple onion on hydroxyl radicals

由图4可知，黑洋葱和紫皮洋葱均具有较强的羟基自由基的清除作用，并随着样品浓度的增加，对羟基自由基的清除率随之增加。而且黑洋葱多酚的总还原力强于紫皮洋葱。利用SPSS软件对黑洋葱、紫皮洋葱多酚成分总还原力进行测定，结果证明黑洋葱与紫皮洋葱多酚对羟基自由基的清除作用结果，有显著性差异(P<0.01)，说明紫皮洋葱经过发酵后成为黑洋葱后对羟基自由基的清除作用增强。

4 结论

黑洋葱中多酚含量为25.76 mg/g，证明黑洋葱中多酚含量较高。通过使用紫外分光光度计测定紫皮洋葱多酚及黑洋葱多酚对DPPH自由基的清除率和羟自由基的清除率，发现黑洋葱及紫皮洋葱多酚都具有良好的体外抗氧化活性，表现出很强的清除自由基的能力。而且黑洋葱多酚的抗氧化能力大于紫皮洋葱多酚的抗氧化能力。在实验浓度范围内，黑洋葱多酚及紫皮洋葱多酚对自由基的清除率随溶液浓度的增大而升高，黑洋葱多酚及紫皮洋葱多酚的总还原能力实验证明二者对铁离子具有良好的还原能力，将 Fe3+还原成Fe2+，反应液的颜色进而改变，而且相同浓度下黑洋葱多酚的总还原力大于紫皮洋葱多酚的总还原力。经过3种抗氧化实验表明，将紫皮洋葱发酵成为黑洋葱，在抗氧化方面有极大提高，同时改善了紫皮洋葱的刺激性气味。研究了其在抗衰老、抗氧化以及与衰老相关疾病治疗中的应用。因此，洋葱加工成黑洋葱的抗氧化活性值得关注与研发。