山苍子果渣对湖羊体外瘤胃发酵特性的影响

罗 阳，李昊帮，何 芳，浣 成，李剑波，易康乐，孙 鏖

(湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131)

山苍子(Litseacubeba)别名木姜子、山胡椒，为樟科(Lauraceae)木姜子属(Litsea)多年生落叶灌木或乔木，在我国长江流域以南有广泛分布，因地域差异而有种群区别，仅在主产区湖南省就发现了18个种及5个变种[1-2]。其果实与叶片富含单萜烯类化合物(主成分α-柠檬醛及β-柠檬醛、柠檬烯、芳樟醇等)[3-4]，可用于制备多种食品添加剂，具有较高的经济价值。

将棉籽、大豆、菜籽等农产品加工副产物作为饲料资源开发一直是我国饲料工业缓解饲草短缺与工业废弃物污染的有效途径。近年来，我国每年山苍子精油产量4 000余t，因提取精油而产生的果渣饼粕达20余万t，成为亟待研究开发的饲料资源[5]。山苍子因其挥发油具有抗菌活性、抗氧化性能以及消炎作用被广泛用于食品、医药、化工等行业[6-9]，而饲料中添加抗氧化剂对缓解动物机体氧化应激，增强动物的抗应激能力具有重要作用[10-11]，且其抗菌活性能有效防止饲料霉变、促进动物机体健康。有研究者认为，植物精油极有可能成为未来动物生产中抗生素的替代品[12]。对反刍动物而言，植物精油因具备生物活性功能对瘤胃发酵具有积极的调控作用[13]。可见，山苍子果渣作为精油提取的加工副产品在饲料领域具有良好的应用前景。为了探究山苍子果渣资源的饲用价值，将山苍子果渣与羊草进行体外产气试验，初步评定其在反刍动物饲料中的利用价值，对反刍动物新型饲料资源开发和山苍子新功能的利用与推广具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 样品制备与常规营养成分测定

供试山苍子由中南林业科技大学林学院提供，羊草由湖南省奶牛原种场提供。羊草65 ℃烘干，粉碎后过425 μm孔径标准筛，在4 ℃冷库中保存。山苍子研磨后65 ℃烘干除去植物挥发油，研磨后的果渣经粉碎后过425 μm孔径标准筛，在4 ℃冷库中保存。饲料样品干物质(DM)含量参照文献[14]方法测定，粗灰分(Ash)含量参照文献[15]方法测定，粗脂肪(EE)含量参照文献[16]方法测定，粗蛋白(CP)含量参照文献[17]方法测定，中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的含量采用Van Soest氏法测定[18]。

1.2 人工瘤胃液配制

瘤胃体外产气试验参照MENKE等[19]的方法，于晨饲前采集3头健康状况良好且装有永久性瘤胃瘘管成年湖羊的瘤胃液，混合后经4层纱布过滤，与9倍体积的人工唾液混合[20]，得到人工瘤胃液。

1.3 试验设计

采用压力读取式体外产气技术(RPT)分别对山苍子果渣和羊草的发酵特性进行研究[21]，每组5个重复，空白对照组不加底物用于校正。称取0.5 g(干物质基础)山苍子果渣与羊草样品，分别置于120 mL产气瓶中，在厌氧培养箱(型号M2000，美国Coylab公司)中除去氧气，随后转移到厌氧培养箱 (氧气含量低于10 mg/kg，氢气分压为7.2%)，然后往产气瓶中注入50 mL的人工瘤胃液，取出置于39 ℃的隔水式恒温培养箱连续培养48 h。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 体外产气量测定 利用压力传感器及配套软件分别读取发酵2、4、6、9、12、24、36、48 h产气瓶内的压力值，根据各时间点底物的产气压力按以下公式转换成产气体积(空白对照用于校正产气量)：

GPt=Pt×(V0-50)/(101.3×W)

式中，GPt为底物在t时间段内的产气量(mL)，Pt为t时间段读取的压力值(kPa)，V0为产气瓶体积(mL)，101.3为标准大气压(kPa)，W为底物干物质质量(kg)，产气过程中的累计产气量为各时间段的产气量之和。

1.4.2 挥发性脂肪酸(VFA)及pH 值的测定 参照MAURICIO等[21]的方法利用气相色谱仪测定。48 h终止培养后，取1 mL发酵培养液，加入50 μL 85%的正磷酸，4 ℃条件下20 000×g离心10 min，取上清液置于4 ℃冰箱中保存备用，用气相色谱仪测定发酵液中乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸的含量。利用便携式pH计(型号PB-10，德国Sartorius公司) 测定发酵液的pH值。

1.4.3 氨态氮(NH3-N)质量浓度及甲烷含量测定 利用比色法测定氨态氮的质量浓度。取5 mL体外发酵培养液，3 500 r/min离心10 min，取上清，以氯化铵为标准品，用可见分光光度计(型号721型，上海光学仪器厂)测定700 nm波长条件下上清液中氨态氮的质量浓度。采用气相色谱法测定甲烷含量。用大剂量气体进样器吸取1.2 mL气体样品，用气象色谱仪(型号Shimadzu GC-9A，日本岛津公司)分析气体中甲烷的含量。

1.5 数据分析

原始数据经Excel 初步处理后，用SPSS 19.0 进行独立样本t检验分析，结果用平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 山苍子果渣与羊草常规营养成分分析

由表1可知，山苍子果渣的干物质、粗脂肪、粗蛋白以及中性洗涤纤维含量均高于羊草，差异极显著(P<0.01)；酸性洗涤纤维含量低于羊草，差异极显著(P<0.01)。山苍子果渣钙含量低于羊草，但差异不显著(P>0.05)；磷含量低于羊草，差异显著(P<0.05)。

表1 山苍子果渣与羊草常规营养成分(干物质基础)Tab.1 Nutrients of Litsea cubeba residue and Leymus chinensis (DM basis) %

注：同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note：In the same row,values with different capital letter superscripts mean extremely significant difference(P<0.01),and with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05),the same below.

2.2 山苍子果渣和羊草的产气分析

从表2可以看出，山苍子果渣在整个试验阶段产气量均极显著(P<0.01)低于羊草，且山苍子果渣在发酵前9 h内产气量为负值，6 h后产气速率虽有所上升，但在36 h后基本停止产气。而羊草在前12 h内产气速率稳定，但速率较低，24 h时速率达到峰值，24～48 h产气速率逐渐下降。

2.3 山苍子果渣和羊草发酵参数

由表3可知，整个试验中山苍子果渣甲烷产量为0，显著低于羊草组(P<0.01)。体外产气发酵48 h后，山苍子果渣和羊草体外发酵培养液pH值分别为6.67、6.54，差异极显著(P<0.01)；氨态氮质量浓度分别为0.66 mg/mL、0.71 mg/mL，无显著性差异(P>0.05)。山苍子果渣培养液中总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸浓度均极显著(P<0.01)低于羊草，戊酸浓度显著(P<0.05)低于羊草，但乙酸/丙酸与羊草差异不显著(P>0.05)。

表2 不同发酵时间段山苍子果渣与羊草累计产气量

表3 山苍子果渣和羊草单独作为底物时的发酵参数Tab.3 Fermentation parameters of Litsea cubeba residue and Leymus chinensis as substrate alone

3 结论与讨论

3.1 山苍子果渣营养成分分析

饼粕、糟渣类饲料经常被用来替代反刍动物日粮中精料组成部分，我国南方由于优质饲料资源匮乏，使得因地制宜开发供应量大、饲喂价值高的地方性饲草资源成为热门关注话题。饲料中粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量是初步评判反刍动物饲料营养价值和饲用价值的重要依据。本试验中，山苍子果渣粗蛋白含量较羊草高，说明山苍子果渣是一种优质的蛋白质资源，具有一定的利用价值；山苍子果渣粗脂肪含量明显高于羊草，主要原因是籽实类原料油脂含量较高，研磨后仅去除了可挥发的植物精油，不可挥发的类脂肪依然有残留。从数据上分析，山苍子果渣具有成为一种非常规饲料进行开发利用的潜力。

3.2 山苍子果渣对瘤胃产气的影响

相对于中性洗涤纤维，饲料中的粗蛋白更容易被反刍动物瘤胃降解发酵，这两项营养指标与瘤胃产气发酵特性直接相关，NSAHLAI等[22]也证实了粗蛋白、中性洗涤纤维与产气量之间的关系。本试验中，山苍子果渣粗蛋白和中性洗涤纤维都高于羊草，但产气试验数据却出现反常，整个产气阶段山苍子果渣组发酵受到抑制，这可能与发酵底物自身特性以及瘤胃微生物降解能力有关[23]。大量研究证明，山苍子精油对真菌、细菌等微生物具有广谱的抑菌效果[24-27]，吴均等[28]研究山苍子精油的抑菌效果发现，5%的山苍子精油对金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌有明显的抑制功能；HU等[29]以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为研究对象，发现山苍子精油对其细胞膜具有破坏作用，导致细胞内生物大分子渗漏而死亡。本试验中，山苍子果渣对瘤胃微生物的抑制，很可能与底物中残留的山苍子精油和精油之外的萜类物质有关，石宁等[30]研究发现，添加400 mg/L山苍子精油对肉羊体外瘤胃发酵产生抑制作用，与本研究结果一致。

3.3 山苍子果渣对瘤胃体外发酵特性的影响

常规营养指标并不能准确地评定饲料的营养价值，饲料的资源化利用还与其适口性、消化率以及饲喂动物种类等因素有关。反刍动物瘤胃中栖息着数量庞大、复杂多样的微生物菌群，瘤胃发酵特性直接影响饲料消化、营养物质吸收和能量代谢。瘤胃pH值反映底物发酵产生碱性物质和有机酸的生成，山苍子果渣经48 h体外产气发酵后，发酵液pH值略高于羊草，可能是由于羊草在发酵时产生了较多的挥发性脂肪酸。山苍子果渣在整个产气阶段甲烷产量为0，显著低于羊草组，可能是山苍子果渣残留有挥发性精油，抑制了瘤胃微生物的生长，使得甲烷生成也受到抑制，OSKOUEIAN等[31]也证实了植物精油在抑制瘤胃产气的同时，还能降低甲烷的产量。另外，山苍子精油本身也有抑制甲烷生成的能力，石宁等[30]在添加400 mg/L山苍子精油时，甲烷产量降低了48.6%，与本试验结果一致。

乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸是瘤胃碳水化合物发酵的主要产物，其主要作用是维持瘤胃内环境稳定，并能给反刍动物提供70%～80%的能量[32]。本试验中，山苍子果渣抑制瘤胃产气发酵，导致乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸生成均低于羊草，除了与山苍子果渣残留抑菌物质有关外，还可能是因为饼粕类饲料纤维素与半纤维素含量低于羊草，再加上木质素的屏障作用，使得挥发性脂肪酸生成的前体物质不足，这与武月雷等[33]研究油茶籽粕体外发酵结果一致。本试验中，山苍子果渣发酵氨态氮含量低于羊草，可能是残留植物精油抑制瘤胃超级产氨菌的生长而引起的。张然等[34]研究发现，添加牛至油质量浓度为400 mg/L时，氨态氮含量降低了20.3%，与本试验结果一致。虽然山苍子果渣对瘤胃产气表现出抑制性，但由于果渣中某些养分易被降解，在产气试验初已产生氨态氮，产气中后期微生物生长又受到抑制，氮源无法被微生物利用合成微生物蛋白，在发酵液中长时间累积，导致最终氨态氮含量与羊草组差异不显著。

山苍子果渣对瘤胃产气发酵有抑制作用，能有效降低甲烷产量，在反刍动物饲料中不宜大量添加，其添加上限以及抑制产气的原因还需进一步研究。