江西省3个地方鸡种遗传多样性分析

谭玉文，饶友生，刘慧琳，肖月玲,2，徐 霞,3，陈 颖，朱学农

(1.南昌师范学院 生物技术研究所/江西省地方鸡种遗传改良重点实验室，江西 南昌 330032；2.城南中学，江西 永新 343400； 3.江西省南城县第一中学，江西 抚州 344700)

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指DNA序列上单个核苷酸的变化，其核苷酸变异主要是由碱基的颠换、转换、插入或缺失所引起的[1]。SNP由于其分布广、遗传稳定性强、密度高且易于自动化检测等优点，被认为是第3代分子遗传标记。SNP不仅运用于寻找人类遗传病相关基因的突变位点，而且在构建家禽遗传连锁图谱和遗传育种中也被广泛应用[2]。同时SNP可能对发生在编码区的基因的功能特性产生影响，对家禽的生产性能、肉质、抗病性能进行数量性状基因座(QTL)分析具有重要意义[3-4]。

宁都黄鸡、白耳黄鸡和安义瓦灰鸡都是江西省优质地方鸡种，有着优异的生产性能和营养价值。近年来，江西省为这3个鸡种种质资源保护投入了大量的人力与物力。以宁都黄鸡、白耳黄鸡和安义瓦灰鸡3个品种为研究对象，在鸡1号染色体的Contig.060226.1上500 kb区域选取25个SNP位点进行飞行质谱分型，并进行遗传多样性比较及遗传距离的分析，以揭示3个地方鸡种的遗传特征，为江西省地方鸡品种资源开发和种质资源保护提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试动物

宁都黄鸡(155只)来自江西赣州宁都黄鸡保种场，白耳黄鸡(150只)来自江西上饶广丰白耳黄鸡保种场，安义瓦灰鸡(158只)来自江西南昌安义瓦灰鸡保种场。

1.2 血液采集及DNA提取

用一次性注射器从鸡翅静脉中抽取约1 mL血液，注入经高压灭菌后并装有35 μL 2% EDTA抗凝剂的离心管内，摇匀并编号，-20 ℃保存。用NRBC Blood DNA提取试剂盒(OMEGA公司)提取供试鸡血液的总DNA，以1%琼脂糖凝胶电泳检测，用Nanodrop 2000检测DNA含量，稀释成终质量浓度为100 ng/μL，-20 ℃保存，用于后续的飞行质谱分型分析。

1.3 飞行质谱分型

采用Sequenom Mass Array系统(北京华诺时代科技有限公司)对已选定的25 个SNP 位点在宁都黄鸡、白耳黄鸡、安义瓦灰鸡3个群体中进行基因型分型。基因型分型的具体步骤如下：①以各SNP 位点为中心在其前后截取100 bp以上长度的DNA 序列，利用Assay Designer设计各位点相应的引物；②以提取的总DNA为模板进行PCR扩增，再对PCR产物碱性磷酸酶处理后进行单碱基延伸反应；③将产物转移到Spectro芯片上，用飞行时间质谱(MALDI-TOF)进行分析[5]。

1.4 数据处理与统计分析

检测结果使用TYPER 4.0软件分型，利用Microsatellite Toolkit软件计算有效等位基因数(Ne)、表观杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)。用Popgene 32软件进行群体Nei氏遗传距离、相似性分析及聚类分析，并对各位点进行Hardy-Weinberg平衡检验。

2 结果与分析

2.1 3个鸡群体遗传多样性的比较

由表1可知，25个SNP在3个鸡群体中的平均有效等位基因数、期望杂合度和多态信息含量分别为1.636、0.367和0.291，其中白耳黄鸡的平均有效等位基因数、期望杂合度和多态信息含量最高(1.684、0.387和0.303)；安义瓦灰鸡最低(1.562、0.328和0.262)；宁都黄鸡平均值介于白耳黄鸡和安义瓦灰鸡之间(1.662、0.386和0.302)。宁都黄鸡和安义瓦灰鸡表观杂合度均为0.271，白耳黄鸡的表观杂合度最高为0.290。

表1 3个鸡群体中25个SNP位点的遗传参数Tab.1 Genetic parameters of 25 SNPs in three chicken populations

续表1 3个鸡群体中25个SNP位点的遗传参数Tab.1(Continued) Genetic parameters of 25 SNPs in three chicken populations

2.2 3个鸡群体遗传距离和聚类分析

用Popgene 32软件对3个鸡群体间的Nei氏相似性系数和遗传距离进行分析，同时根据遗传距离，采用UPGMA法进行聚类分析。白耳黄鸡和安义瓦灰鸡的相似性最高，为0.963 4，宁都黄鸡与白耳黄鸡相似性为0.952 6，宁都黄鸡与安义瓦灰鸡相似性最低为0.931 0(表2)；聚类分析显示，安义瓦灰鸡与白耳黄鸡聚为一类，宁都黄鸡单独聚为一类(图1)。

表2 3个鸡群体间的Nei氏遗传相似性系数(右上)和遗传距离(左下)Tab.2 Nei’s genetic similarity coefficient(upper right) and genetic distance(lower left) in three chicken populations

2.3 3个鸡群体的Hardy-Weinberg平衡检验

由表3可知，宁都黄鸡中有10个SNP位点不符合遗传平衡法则，白耳黄鸡中有16个SNP位点不符合遗传平衡法则，安义瓦灰鸡中有11个SNP位点不符合遗传平衡法则，3个鸡群体部分位点偏离的这种现象可能是各保种场对鸡群进行人工选育的结果。

图1 3个鸡群体基于Nei氏遗传距离的UPGMA聚类图Fig.1 UPGMA clustering map based on Nei’s genetic distance in three local breeds

3 结论与讨论

遗传多样性的检测能有效地指导育种方案的制定和工作成果的检验，其中杂合度、等位基因数和多态信息含量是评价遗传多样性3个重要的参数[6]。在本研究中，宁都黄鸡、白耳黄鸡和安义瓦灰鸡在25个位点的平均期望杂合度分别为0.386、0.387、0.328，且平均表观杂合度低于平均期望杂合度，可能是不同群体由于地域隔离经历了一定程度的近交或自交，引起杂合子缺失，纯合子比例较高[7]，或者是出现了基因突变或者随机性的基因漂移导致这种情况[8]。多态信息含量是评估群体遗传多样性和衡量等位基因片段多态性的理想指标。当PIC>0.50时，表示具有高度多态性；当0.25

表3 3个鸡群体25个SNP位点的Hardy-Weinberg平衡检验Tab.3 Hardy-Weinberg equilibrium test of 25 SNPs loci in three breeds

注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

Note: * indicates that the difference is significant (P<0.05), ** indicates that the difference is extremely significant (P<0.01).

遗传距离是指不同的种群或种间的基因差异的程度，估算群体间的遗传距离是探究物种起源、构建系统发育树、分析群体间亲缘关系的基础[12]，并对育种中指导亲本选配有着积极的作用。本研究中，3个品种的遗传相似性指数都大于90%，说明这3个品种的亲缘关系都比较近，聚类分析结果显示，安义瓦灰鸡与白耳黄鸡聚为一类，宁都黄鸡单独聚为一类，这个结果也与陈宽维等[10]的聚类结果相一致。Hardy-Weinberg平衡的检验结果显示部分位点处于不平衡的状态，这与张德宁等[13]对黄选1号三疣梭子蟹生长性状SNP的研究结果相类似。偏离Hardy-Weinberg平衡的位点可能是人工选育、遗传漂变等因素所致，3个鸡群都是经过多代人工选育的种群，这样可能会引起杂合子丢失，导致部分等位基因的频率发生改变。