不同作物伴生对连作黄连产量和根际土壤微生物群落的影响

牛四坤

(山西药科职业学院 药学系，山西 太原 030031)

黄连(Coptischinensis)，又称味连、鸡爪连，属毛茛科黄连属多年生草本植物，其清热燥湿、泻火解毒功效显著[1]。黄连是典型的忌连作药用植物，连作常导致植株生长发育不良、病虫害频发，产量和品质大幅下降，严重制约黄连的产业化发展[2-3]。为减少黄连病害，药农在生产中往往使用大量的化学农药进行防治，不仅造成黄连药材安全隐患，而且对土壤环境造成一定的污染[4]。近年来，人们对中药材品质提出越来越高的要求，采用无公害手段缓解黄连连作障碍已成为当前亟待解决的关键问题之一[5]。

植物连作障碍的作用机制非常复杂，主要包括化感自毒作用、土壤生态环境灾变等[6-7]。大量研究表明，由植物根际自毒物质介导的微生物群落结构失衡是造成连作障碍发生的主要因素，合理调控土壤微生物多样性和群落结构是缓解连作障碍的关键所在[8-10]。近年来，利用生物间相生相克的原理合理安排作物间、轮、套作制度，已成为无公害缓解连作障碍的研究热点之一[11]。相关研究表明，大葱间作桔梗可提高土壤细菌数量并降低真菌数量，缓解桔梗连作障碍[12]；生菜与菠菜轮作可提高土壤细菌的多样性和丰富度，改善群落结构，缓解生菜连作障碍[13]；小麦与蚕豆间作可改善蚕豆根际土壤真菌的群落结构，提高多样性和丰富度，降低镰刀菌数量，缓解蚕豆连作障碍[14]。

伴生栽培是一种新型的栽培方式，不以收获伴生植物为目的，主要是利用伴生植物的相生相克作用达到缓解连作障碍的效果[15]。伴生栽培与间、轮、套作的最大区别是不以收获伴生植物为目的，从而减少了伴生作物对土壤水分、养分的争夺，最大程度保障主栽作物的收益。杨瑞娟等[16]研究表明，大麦伴生栽培可提高番茄根区的土壤酶活性，改善微生物群落结构，降低根结线虫发生率。徐伟慧[17]研究表明，小麦伴生可显著提高连作条件下西瓜根际土壤微生物多样性，改善群落结构，提高连作西瓜产量，降低枯萎病发病率。目前，中药材连作障碍的缓解仍以化学手段为主，无公害缓解手段较为缺乏。伴生植物对中药材植物连作障碍的缓解效果以及根际微生物群落结构的影响尚未见相关报道。因此，以黄连为试验材料，研究了小麦、大葱及黑麦草伴生栽培对连作黄连产量及发病率的影响，筛选出最佳的黄连伴生植物，并从根际微生物区系变化方面对其作用机制进行初探，以期为黄连连作障碍的无公害缓解提供参考和借鉴。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试土壤取自山西省运城市黄连种植基地，非黄连连作土壤基本理化性质为pH值7.15，EC值6.11，有机质、速效氮、速效磷、速效钾含量分别为46.52 g/kg、61.12 mg/kg、30.52 mg/kg、53.56 mg/kg；连作3 a土壤基本理化性质为pH值6.25，EC值6.83，有机质、速效氮、速效磷、速效钾含量分别为52.65 g/kg、52.65 mg/kg、26.82 mg/kg、50.06 mg/kg。供试黄连品种为黄连1号，购自安康市振兴集团生物科技有限公司。供试3种伴生作物中，小麦品种为品资Ⅱ-5，由黑龙江农业科学院提供；大葱品种为章丘大葱，购自菏泽市三系大葱良种有限公司；黑麦草品种为杰威，购自四川金种燎原种业科技有限责任公司。

1.2 试验设计

试验于2018年4月10日开始实施，采用小区完全随机区组设计，共设5个处理，分别为头茬黄连(CK1)、连作3 a黄连(CK2)、连作3 a黄连与小麦伴生栽培(T1)、连作3 a黄连与大葱伴生栽培(T2)和连作3 a黄连与黑麦草伴生栽培(T3)。小区面积30 m2，平畦栽培，选取长势、大小一致的黄连幼苗进行定植，株行距为10 cm×15 cm，每个处理3次重复。黄连幼苗定植后1周，于距离黄连幼苗植株6 cm处分别点播小麦、大葱和黑麦草种子进行伴生处理。伴生植物株高长到30 cm左右时，人工留茬至10 cm左右，留茬的生长点继续生长。整个试验期间，各处理由专人进行统一的水肥管理，同时杜绝使用杀菌剂。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 产量 试验结束后收获时测定各处理的黄连产量，并进行换算。

1.3.2 发病率 调查整个试验期间黄连的发病株数并计算发病率，发病率=发病株数/定植株数×100%。

1.3.3 土壤微生物数量、多样性及群落结构

1.3.3.1 土壤取样方法 于黄连发病盛期，用5点采样法采集各处理的根际土壤，并保存于-80 ℃超低温冰箱，用于土壤微生物数量、多样性及群落结构分析。

1.3.3.2 微生物数量测定 土壤细菌、真菌及放线菌数量测定采用稀释平板法，培养基分别为牛肉膏蛋白胨培养基、孟加拉红培养基和改良高氏一号培养基。

1.3.3.3 土壤微生物总DNA提取 采用 Fast DNA®SPIN Kit for Soil土壤总基因组提取试剂盒提取，用NanoDrop 2000紫外微量分光光度计测定DNA质量与浓度，采用琼脂糖凝胶检测DNA完整性。

1.3.3.4 土壤细菌高通量测序 以土壤总DNA为模板，以Miseq测序平台通用引物F341-R806对V3-V4区进行扩增。PCR反应体系为：10×PCR buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 U/μLTaq酶0.25 μL，DNA模板2 μL，正反向引物各0.5 μL，灭菌超纯水12.75 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸6 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，用凝胶回收试剂盒回收目的产物，并根据回收DNA浓度，按照1∶1的比例等量进行混合，交送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.3.3.5 土壤真菌高通量测序 以土壤总DNA为模板，以通用引物ITS1(5′-TCCGTTGGTGAACCAGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG-

C-3′)对真菌ITS区进行扩增。PCR反应体系与细菌反应体系一致。PCR反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸6 min。PCR产物回收参照细菌PCR扩增产物回收方法，回收产物按1∶1等量混合并进行测序。

1.4 数据统计及分析

采用QIIME软件对原始测序数据进行去杂和优化，利用UPARES软件对相似度在97%水平以上的有效数据进行生物信息统计分析，并基于细菌的Silva数据库和真菌的Unite数据库统计各样本在不同分类学水平上的群落组成。利用MOTHUR软件进行土壤微生物α多样性分析，包括Chao1丰富度指数、Ace丰富度指数、Shannon指数和Simpson 指数。采用Excel 2007和SPSS 18.0分别进行数据整理作图和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同作物伴生对连作黄连产量及发病率的影响

由图1可以看出，连作显著降低黄连产量、提高黄连发病率，而伴生栽培则可不同程度地缓解黄连连作障碍。与头茬黄连(CK1)相比，连作3 a的黄连(CK2)产量降低43.29%，发病率提高59.92个百分点。伴生栽培可显著提高连作黄连产量、降低黄连发病率。其中，T1、T2和T3处理黄连产量分别较CK2显著提高53.31%、67.63%、42.92%，发病率分别较CK2显著降低39.13、47.32、32.50个百分点。说明伴生栽培可显著缓解黄连的连作障碍，其中，以大葱伴生栽培缓解黄连连作障碍效果最佳。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

2.2 不同作物伴生对连作黄连根际微生物数量的影响

由表1可以看出，连作显著降低黄连根际土壤细菌和放线菌含量，显著提高真菌含量，最终使微生物总量显著降低。与CK1相比，连作3 a的黄连根际土壤微生物总量降低4.14%，其中，细菌和放线菌含量分别降低18.20%和21.20%，真菌含量提高60.37%，细菌/真菌和放线菌/真菌显著降低，土壤由细菌型向真菌型转化。

伴生栽培可显著提高连作条件下黄连根际土壤的细菌、放线菌含量，显著降低真菌含量。T1、T3处理微生物总量较CK2分别提高1.95%、0.49%，其中，细菌含量分别提高14.06%、9.08%，放线菌含量分别提高11.49%、5.52%，真菌含量分别降低21.67%、14.83%，细菌/真菌分别提高45.61%、28.07%，放线菌/真菌分别提高42.34%、23.89%。T2处理微生物总量虽然较CK2降低1.89%，但主要表现为真菌含量下降(30.61%)，细菌和放线菌含量则分别提高12.15%和10.80%。说明伴生栽培可显著提高连作黄连根际土壤的细菌和放线菌含量，降低真菌含量，促进连作土壤由真菌型向细菌型转化，其中，以大葱伴生栽培细菌/真菌和放线菌/真菌比值最高。

表1 不同作物伴生栽培对连作黄连根际微生物数量的影响Tab.1 Effects of companion planting with different crops on microorganisms quantity in rhizosphere soil of continuous cropping Coptis chinensis

注：同列不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

2.3 不同作物伴生对连作黄连根际微生物多样性的影响

由表2可知，各处理的细菌、真菌覆盖率均大于98%，说明本研究获得的微生物序列覆盖度较好，可用于细菌、真菌的多样性和群落结构分析。Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数是衡量微生物多样性和丰富度的重要参数，其中，Chao1指数、Ace指数、Shannon指数越大表示样本多样性和丰富度越高，Simpson指数越高代表多样性越低。连作显著降低黄连根际土壤细菌和真菌的多样性和丰富度。与CK1相比，连作3 a的黄连根际土壤细菌Chao1指数、Ace指数、Shannon指数分别显著降低11.65%、11.61%、21.63%，而Simpson指数提高30.77%；根际土壤真菌Chao1指数、Ace指数、Shannon指数分别显著降低41.13%、41.00%、32.46%，Simpson指数提高83.33%。

伴生栽培可显著提高连作条件下黄连根际土壤的细菌、真菌多样性。与CK2相比，T1、T2、T3处理细菌Chao1指数分别提高7.84%、11.03%、4.57%，Ace指数分别提高7.53%、10.76%、4.35%，Shannon指数分别提高15.07%、21.53%、10.57%，Simpson指数分别降低13.24%、17.65%、7.35%；真菌Chao1指数分别提高40.81%、54.08%、30.32%，Ace指数分别提高40.39%、52.81%、29.73%，Shannon指数分别提高28.64%、36.41%、15.53%，Simpson指数分别降低27.27%、15.15%、36.36%。说明伴生栽培可显著提高连作黄连根际土壤细菌和真菌的多样性与丰富度，其中，以大葱伴生栽培多样性和丰富度最高。

表2 不同作物伴生栽培对连作黄连根际微生物多样性的影响Tab.2 Effects of companion planting with different crops on microorganisms diversity in rhizosphere soil of

注：同列不同小写字母表示同一微生物种类不同处理间差异显著(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level among different treatments of the same microbial species.

2.4 不同作物伴生对连作黄连根际微生物群落结构的影响

2.4.1 细菌群落结构 如图2A所示，5种种植模式下，土壤优势细菌在门水平上相同，主要包括变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chloroflexi)、消化螺旋杆菌门(Nitrospirae)和绿藻门(Cyanobacteria)，约占细菌总丰度的92.83%～96.08%。与CK1相比，连作3 a的黄连根际土壤酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门和消化螺旋杆菌门相对丰度显著降低，而厚壁菌门、浮霉菌门、拟杆菌门和绿湾菌门相对丰度显著上升(P<0.05)。与CK2相比，伴生栽培可显著提高连作条件下黄连根际土壤酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门和消化螺旋杆菌门相对丰度，显著降低厚壁菌门、浮霉菌门、拟杆菌门和绿湾菌门相对丰度(P<0.05)，其中，以大葱伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、消化螺旋杆菌门相对丰度分别提高20.43%、54.68%、62.30%、100.00%，厚壁菌门、浮霉菌门、拟杆菌门、绿湾菌门相对丰度分别降低33.81%、21.66%、20.11%、58.54%。

如图2B所示，土壤优势细菌属在黄连5种种植模式根际土壤中表现一致，约占细菌总丰度的51.88%～53.37%，但是相对丰度存在较大差异。与CK1相比，连作3 a的黄连根际土壤红游动菌属(Rhodoplanes)、韦荣球菌属(Veillonella)和乳球菌属(Lactococcus)相对丰度均显著降低，而柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、链球菌属(Streptococcus)、普氏菌属(Prevotella)、消化螺菌属(Nitrospira)和假单胞菌属(Pseudomonas)则显著升高(P<0.05)。与CK2相比，伴生栽培可显著提高连作条件下黄连根际土壤红游动菌属、韦荣球菌属和乳球菌属相对丰度，显著降低柠檬酸杆菌属、链球菌属、普氏菌属、消化螺菌属和假单胞菌属相对丰度(P<0.05)，其中，以大葱伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，红游动菌属、韦荣球菌属、乳球菌属相对丰度分别提高28.03%、35.34%、91.75%，柠檬酸杆菌属、链球菌属、普氏菌属、消化螺菌属、假单胞菌属相对丰度分别降低17.48%、40.68%、45.27%、60.78%、63.16%。

2.4.2 真菌群落结构 如图2C所示，5种种植模式下，土壤优势真菌门主要包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和纤毛亚门(Ciliophora)，约占真菌总丰度的81.43%～96.82%。连作显著降低了黄连根际土壤子囊菌门、担子菌门、壶菌门和球囊菌门的相对丰度，提高了接合菌门和纤毛亚门的相对丰度。与CK2相比，伴生栽培可显著提高连作条件下黄连根际土壤子囊菌门、担子菌门、壶菌门和球囊菌门的相对丰度，显著降低接合菌门和纤毛亚门的相对丰度，其中，以大葱伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，子囊菌门、担子菌门、壶菌门、球囊菌门相对丰度分别提高26.62%、39.20%、50.00%、117.11%，接合菌门和纤毛亚门相对丰度分别降低49.25%和22.13%。

A.细菌门水平相对丰度；B.细菌属水平相对丰度；C.真菌门水平相对丰度；D.真菌属水平相对丰度

如图2D所示，黄连5种种植模式具有相同的优势真菌属，约占真菌总丰度的48.60%～59.52%，不同种植模式间相对丰度存在较大差异。连作显著降低了黄连根际土壤支顶孢属(Acremonium)、绿僵菌属(Metarhizium)、柄孢壳属(Zopfiella)和链孢菌属(Alternaria)的相对丰度，提高了假霉样真菌属(Pseudallescheria)、被孢霉属(Mortierella)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)和丝孢菌属(Scedosporium)的相对丰度。与CK2相比，伴生栽培可显著提高连作条件下黄连根际土壤支顶孢属、绿僵菌属、柄孢壳属和链孢菌属的相对丰度，显著降低假霉样真菌属、被孢霉属、镰刀菌属、青霉属和丝孢菌属的相对丰度(P<0.05)，其中，以大葱伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，支顶孢属、绿僵菌属、柄孢壳属、链孢菌属相对丰度分别提高86.58%、36.19%、851.61%、54.55%，假霉样真菌属、被孢霉属、镰刀菌属、青霉属、丝孢菌属相对丰度分别降低32.62%、30.03%、44.95%、24.12%、42.11%。

2.5 土壤微生物菌群丰度与黄连发病率的相关性分析

由表3可知，与黄连发病率呈正相关的菌属有12类，相关性由强到弱依次为假霉样真菌属、被孢霉属、镰刀菌属、柠檬酸杆菌属、链球菌属、青霉属、普氏菌属、丝孢菌属、消化螺菌属、假单胞菌属、浮霉菌属和生丝微菌属；与黄连发病率呈负相关的菌属有7类，相关性由强到弱依次为红游动菌属、韦荣球菌属、支顶孢属、柄孢壳属、乳球菌属、绿僵菌属和链孢菌属。

表3 土壤微生物菌群丰度与黄连发病率的相关性Tab.3 Correlation between abundance of soil microbial community and disease incidence of Coptis chinensis

注：*表示在0.05水平上显著相关，**表示在 0.01 水平上显著相关。

Note:* indicates a significant correlation at 0.05 level; ** indicates a significant correlation at 0.01 level.

3 结论与讨论

大量研究表明，连作会对植物的生长发育产生负面影响，显著降低作物的产量和品质，提高作物发病率，而合理的栽培制度(如连作、轮作、套作等)可起到一定的缓解作用[3,7-8]。本研究发现，连作3 a的黄连产量较头茬黄连降低43.29%，发病率提高59.92个百分点。分析原因，一方面，连作降低了黄连根际土壤的微生物数量，导致土壤酶活性降低、有机质分解速度减缓，土壤养分含量降低，从而导致作物减产，这与王鹏等[12]的分析结果类似；另一方面，连作破坏了黄连根际土壤的微生态环境，促使土壤由细菌型向真菌型转化，病原菌数量增多、有益菌数量减少，从而导致病害加重，与洪洁等[13]的结论相似。本研究结果表明，伴生栽培对黄连连作障碍具有一定的缓解效果，小麦、大葱及黑麦草3种作物伴生栽培中，以大葱伴生栽培缓解效果最佳，产量较连作3 a的黄连提高67.63%，发病率降低47.32个百分点，与赵晓翠[15]、杨瑞娟等[16]、韦持章等[18]结论一致，这一方面是因为伴生栽培提高了黄连根际土壤的细菌、放线菌含量，从而缓解了因土壤酶活性降低而导致的土壤养分含量不足；另一方面，伴生栽培降低了根际土壤真菌含量，促使连作土壤由真菌型向细菌型转化，改善了土壤微生态环境，从而降低了发病率。

土壤微生物是反映土壤生态系统的重要参数，参与土壤养分循环、有机质分解等重要的物质转化和能量交换过程，其功能多样性与土壤微生态环境稳定性密切相关[19]。根际土壤微生物多样性和群落结构受植物根系分泌物调控，由于植物根系自毒物质的积累而导致的微生物群落结构失衡是造成连作障碍发生的主要因素[8-10]。植物间作、套作等栽培制度不仅可以增加地上部的物种多样性，而且可以通过根系分泌物对土壤微生态环境起到调控作用[14，20]。本研究发现，连作导致黄连根际土壤细菌和真菌的Chao1指数、Ace指数及Shannon指数显著降低，Simpson指数分别显著升高30.77%和83.33%(P<0.05)；伴生栽培可显著提高连作黄连根际土壤细菌和真菌的多样性与丰富度，小麦、大葱及黑麦草3种作物伴生栽培中以大葱伴生效果最好，根际土壤细菌Chao1指数、Ace指数、Shannon指数分别较连作3 a土壤提高11.03%、10.76%、21.53%，Simpson指数降低17.65%，真菌Chao1指数、Ace指数、Shannon指数分别提高54.08%、52.81%、36.41%，Simpson指数降低15.15%，与胡国彬等[14]、徐伟慧[17]的研究结果较为一致。根系分泌物作为土壤微生物的主要能源和碳源，对土壤微生物具有一定的选择和塑造作用，其种类和数量决定了微生物的数量与群落结构，植物连作导致根系分泌物种类过少、数量过多是造成土壤微生物多样性和丰富度降低的主要原因，而伴生栽培丰富了土壤中根系分泌物的种类和数量，增加了可利用的能源和碳源种类，从而提高了土壤微生物的多样性和丰富度。

不同的栽培制度和农艺措施对土壤微生物群落结构具有明显的影响[12-14,18-19]。生菜根际土壤变形菌门、厚壁菌门和放线菌门相对丰度在连作模式下逐渐降低，但是在生菜-菠菜轮作模式中则较为稳定，壤霉菌属、黄杆菌属及微细菌属等有益菌属成为轮作模式的优势菌属[13]。有机物料可显著提高设施番茄长期连作土壤中变形菌门和放线菌门的相对丰度，显著降低酸杆菌门的相对丰度，鞘氨醇单胞菌属、芽孢杆菌属及链霉菌属等有益菌属相对丰度升高，Gp4、Gp6等不利菌属相对丰度降低[21]。本研究发现，连作改变了黄连根际土壤细菌和真菌优势菌门的相对丰度，酸杆菌门、放线菌门、子囊菌门、担子菌门等相对丰度显著降低，而厚壁菌门、浮霉菌门、接合菌门和纤毛亚门等相对丰度显著提高；在属水平，连作显著降低了红游动菌属、韦荣球菌属、支顶孢属及绿僵菌属等优势菌属的相对丰度，而柠檬酸杆菌属、链球菌属、假霉样真菌属及镰刀菌属等相对丰度则显著升高。这主要是由于黄连根系分泌物不断积累而导致微生物区系发生了重塑。伴生栽培丰富了黄连根际土壤中分泌物的种类与数量，进而显著缓解了连作导致的细菌、真菌在门和属水平的相对丰度变化，其中以大葱伴生效果最佳。

土壤微生物菌群丰度与黄连发病率的相关性分析结果表明，假霉样真菌属、被孢霉属、镰刀菌属及柠檬酸杆菌属等相对丰度与黄连发病率呈正相关，其作用机制可能是：一方面，该类菌群中可能有部分菌群本身就是黄连病害的病原菌；另一方面，该类菌群可能通过分解有机物、自身代谢等途径产生促使病原菌侵染植物的物质，导致发病率提高。红游动菌属、韦荣球菌属及支顶孢属等相对丰度与黄连发病率呈负相关，其抗病机制可能涉及自身代谢产生抑制病原菌生长繁殖的分泌物、争夺病原菌养分、诱导植物产生抗病性等多个途径。因此，今后应对此类菌群进行深入研究，以期获得对黄连病害具有生防作用的微生物菌剂。