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壮药龙钻通痹方对胶原诱导型关节炎大鼠Th22/IL-22调控机制研究

2020-02-04张青槐庞宇舟蓝毓营韦露秋陈秋霞田照高慧

中国民族民间医药·上半月 2020年12期
关键词:诱导型类风湿滑膜

张青槐 庞宇舟 蓝毓营 韦露秋 陈秋霞 田照 高慧

【摘 要】 目的:探究壮药龙钻通痹方对胶原诱导型关节炎大鼠(CIA)血清Th22的作用机制。方法:通过牛Ⅱ胶原蛋白与弗氏不完全佐剂混合液诱导类风湿关节炎样的大鼠模型,60只雄性Wistar大鼠随机分为正常组,模型组、甲氨蝶呤组(MTX组),壮药龙钻通痹方(简称壮方)低剂量组1.35g/(kg·d),壮方中剂量组2.7g/(kg·d),壮方高剂量组5.4g/(kg·d),每组各10只。以足跖容积检测仪检测足跖容积变化情况, 流式细胞仪检测和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测Th22、IL-22表达水平,HE染色观察滑膜形态学变化。结果:壮药龙钻通痹方高剂量组显著减小胶原诱导型关节炎模型大鼠的足跖容积(P﹤0.05),降低踝关节炎症细胞浸润,下调Th22蛋白与其效应因子IL-22的表达水平(P﹤0.05)。结论:壮药龙钻通痹方对胶原诱导型关节炎大鼠具有较好的治疗作用,其作用机制可能与抑制Th22蛋白与其效应因子IL-22的表达有关。

【关键词】 类风湿关节炎;壮药龙钻通痹方;Th22;IL-22

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2020)23-0011-04

Study on the Regulation Mechanism of Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Recipe on Th22/IL-22 in Collagen-induced Arthritis Rats

ZHANG Qinghuai PANG Yuzhou LAN Yuying WEI Luqiu CHEN Qiuxia TIAN Zhao GAO Hui*

Guangxi University of TCM,Nanning 530001,China

Abstract:Objective To explore the mechanism of Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Fang on serum Th22 in collagen-induced arthritis rats (CIA). Methods A rheumatoid arthritis-like rat model was induced by a mixture of bovine Ⅱ collagen and Freunds incomplete adjuvant. Sixty male Wistar rats were randomly divided into a normal group, a model group, and a methotrexate group (MTX group) ), Zhuang medicine Long Zuan Tong Bi Fang (referred to as Zhuang Fang) low-dose group 1.35g/(kg·d), Zhuang Fang middle-dose group 2.7g/(kg·d), Zhuang Fang high-dose group 5.4g/(kg·d), 10 animals in each group. The foot and plantar volume detector was used to detect the changes of foot and plantar volume. Flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were used to detect the expression levels of Th22 and IL-22. HE staining was used to observe the changes of synovial morphology.Results The high-dose group of Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Fang significantly reduced the plantar volume of collagen-induced arthritis model rats (P﹤0.05), reduced the infiltration of inflammatory cells of the ankle joint, and down-regulated the Th22 protein and its effector IL-22 Expression level (P﹤0.05). Conclusion Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Recipe has a good therapeutic effect on collagen-induced arthritis rats, and its mechanism may be related to the inhibition of the expression of Th22 protein and its effector IL-22.

Keywords:Rheumatoid Arthritis; Zhuang Medicine Long Zuan Tong Bi Fang; Th22; IL-22

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以对称性关节滑膜病理改变和慢性炎症为主要特征的自身免疫性疾病,临床表现为关节晨僵、肿胀、疼痛、严重者表现为关节畸形,其发病率在我国约为0.32%~0.36%,已成为人群致残的主要疾病之一[1-2]。课题组前期研究表明[3-5],壮药龙钻通痹方可提高 IL-4、IL-10 的水平,能下调关节炎大鼠血清 IFN-γ、TNF-α、MMP-13 水平,提示这可能是其治疗类风湿关节炎的作用机理之一。近年来研究发现,CD4+T细胞亚群失衡与RA的发生发展有密切联系,CD4+T 细胞功能亚群中的Th22细胞及其分泌的白细胞介素-22(IL-22)是類风湿关节炎疾病反应的重要环节[6],Th22细胞水平与其效应因子IL-22在RA患者的滑膜组织表达水平中有上调作用[7]。本病属于壮医“发旺”范畴,壮药龙钻通痹方是广西中医药大学庞宇舟教授治疗活动期类风湿关节炎的经验方,该方能明显降低RA患者的血沉,临床治疗有效率可达85.0%[8],为进一步的临床应用提供客观实验依据。笔者通过分析胶原诱导型关节炎模型大鼠血清Th22和LI-22的表达水平,探讨壮药龙钻通痹方对类风湿关节炎的调控机制。

1 实验材料

1.1 实验动物与分组 SPF级雄性Wistar大鼠60只,体重约170~230g,由广西医科大学动物实验中心提供。饲养于本单位SPF级动物实验房,温度20~25℃,湿度40%~60%,适应性喂养一周后随机分为正常组、模型组、甲氨蝶呤组(MTX组),壮药龙钻通痹方(简称壮方)低剂量组、壮方中剂量组、壮方高剂量组,每组10只。

1.2 药物与试剂 壮药龙钻通痹方由主药飞龙掌血、大钻,帮药八角枫、两面针、青風藤、九龙藤、五指毛桃、鸡血藤等组成,壮医龙钻通痹颗粒由广西中医药大学附属百年乐制药厂生产(批号:20180508);甲氨蝶呤片由通化茂祥制药有限公司生产(MTX,2.5mg/片,生产批号:国药准字H2202267);牛Ⅱ胶原蛋白、弗氏不完全佐剂(IFA)购自Sigma公司,流式抗体(CD4和IL-22)(美国Invitrogen公司),IL-22 ELISA 试剂盒(R&D公司)。

1.3 主要仪器设备 多功能酶标仪(瑞士TEACAN ,M200) ;足跖容积检测仪(成都泰盟,PV-200);高冷冻离心机(德国 Sigma,3K15);倒置显微镜(德国莱卡,DM18) 等。

2 实验方法

2.1 动物模型制备 除正常组外,其余50只按照参考文献[9]所述方法造成CIA大鼠模型,即牛Ⅱ型胶原溶于0.1mol/L的冰醋酸,最终浓度为 2mg/mL后放置在4℃冰箱中过夜,次日将其与等量的弗氏不完全佐剂完全乳化。在大鼠左后跖底部注射乳剂0.2mL/只,7d后再次免疫,即尾根部注射乳剂0.2mL,进而诱发类风湿关节炎大鼠模型。大鼠足爪红肿,足垫增厚,行动迟缓,踝关节炎症细胞浸润,病理切片提示滑膜增厚,表示造模成功。模型制备成功后第7天开始给药,模型组予生理盐水2mL/100g灌胃,每天1次;阳性对照组灌服甲氨蝶呤药液2.7mg/kg(成人临床用药的3倍),每只灌服约0.405mg,每周灌服1次;壮药龙钻通痹方成人标准用量为30g/d,龙钻通痹方高、中、低剂量组分别以龙钻通痹方(含生药16、8、4g/kg)2mL/100g,每日分2次灌胃。正常对照组自由饮水,6组大鼠共喂养21d。

2.2 足跖容积测量 使用足跖容积检测仪测量各组大鼠的足跖容积,测量前在大鼠踝关节做标记,以确保测量的准确性,在灌胃后的第7天、第14天、第21天的下午3点进行测量,动态观察大鼠足跖容积变化情况。

2.3 流式细胞仪检测血清Th22水平、ELISA法检测血清IL-22表达水平 采集大鼠血清2mL,通过静置离心后得到血清样本,各步骤按照产品说明书进行,采用流式细胞仪检测血清Th22表达水平;ELISA法检测血清IL-22表达水平。

2.4 HE 染色法观察踝关节滑膜病理增厚程度 踝关节组织放入4%的多聚甲醛溶液中固定24h后转移至脱钙中,经过包埋、切片、烘干、 脱蜡、HE染色等步骤后,于光镜下观察各组大鼠踝关节滑膜病理切片情况。

2.5 统计学方法 研究数据运用SPSS 19.0 统计软件处理,计量资料以均数加减标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验和校正t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠足跖容积变化情况比较 与正常组相比,模型组大鼠的足跖容积明显大于正常组,在第14天、第21天差异有统计学意义(P<0.05),表明造模成功;与模型组相比,壮方高剂量组与甲氨蝶呤组足跖容积减小(P<0.05),说明壮药龙钻通痹方能够缓解类风湿关节炎CIA大鼠关节肿胀程度;结果见表1。

3.2 各组大鼠血清中Th22、IL-22表达水平比较 与正常组相比,Th22细胞在RA大鼠全血中表达显著高于正常大鼠,模型组大鼠血清中IL-22显著升高;与模型组相比,甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方不同剂量组干预后血清中IL-22水平均有降低,但甲氨蝶呤组和壮方高剂量组降低更显著,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。结果见表2。

3.3各组大鼠踝关节滑膜病理形态比较 HE染色结果显示,正常组大鼠踝关节滑膜无炎症细胞浸润,滑膜表面光滑;模型组滑膜细胞增殖明显,充满炎性物质,层次不清;与模型组相比,壮药龙钻通痹方高剂量剂量组效果明显,炎症细胞较少,表面光滑,滑膜增生得到一定缓解,中剂量组次之,低剂量组与模型组无显著性差异。甲氨蝶呤组和壮方高剂量组效果更好,如图1所示。

4 讨论

类风湿关节炎是一种由遗传、感染、内分泌、免疫等多种因素引起的自身免疫性疾病,现代医学治疗多以改善病情的抗风湿药(DMARDs)或生物制剂来减轻炎性反应、控制疾病进程,但副作用较大,不易被接受[10]。RA属于中医“痹证”的范畴,《素问·痹论》云:“风寒湿三气杂至,合而为痹也。其风气盛者为行痹;寒气盛者为痛痹;湿气盛者为着痹也”[11]。而壮医认为RA的病机实质是“网络阻滞致痹”, 多由风、寒、湿、热等毒邪乘虚侵入人体阻滞于“龙路”、“火路”干线及网络而成,气血运行不畅,导致筋骨肌肉关节疼痛,其壮医病名为“滚克”, 属于壮医“发旺”的范畴,治疗当以“祛邪解毒、疏通两路”为法,使人体三气同步,达到“阴阳和”的健康状态[12]。

壮药龙钻通痹方是庞宇舟教授研制出治疗RA的壮药制剂,壮药龙钻通痹方由飞龙掌血、大钻、八角枫、两面针、青风藤、九龙藤、鸡血藤、五指毛桃根等药物组成。方中飞龙掌血、大钻通调龙路、火路,祛风毒,除湿毒,共为主药;八角枫祛风除湿,散瘀止痛;两面针疏通龙路、火路,清热毒,消肿痛;青风藤调火路,祛风毒,通小便;九龙藤通龙路,调谷道,祛风除湿;鸡血藤补血虚,除湿毒,活血通络;五指毛桃健脾化湿,舒筋活络;诸药合用,共奏通调龙路、火路,祛邪解毒,舒筋通络之功。现代药理研究表明,飞龙掌血[13]的有效成分是香豆素类(如Cp.5)和生物碱类(如Cp.9),根部醇提物和水提物具有强大的镇痛作用,其镇痛机理可能与抑制PGE2疼痛介质表达有关;大钻[14]的有效成分是木脂素类(如联苯环二辛烯型木脂萜)和三萜类,具有抗炎作用,能够减低AA大鼠模型足趾肿胀程度;八角枫[15]主要有效成分是生物碱、酚苷及蒽醌,ZHAI K F等研究发现八角枫中的水杨酸具有抗炎作用,作用机理可能与抑制金属蛋白酶-1、-3的表达有关,青风藤[16]富含青藤碱、乙基青藤碱等生物碱类物质,主要有镇痛、调节免疫系统的作用。由此可见,龙钻通痹方主要是通过抗炎、镇痛、调节免疫等作用来治疗RA的。

类风湿关节炎发病机制复杂,免疫紊乱相关研究是类风湿关节炎当前研究热点,新进研究表明Th22在类风湿关节炎中起到重要作用,Th22分泌的效应因子IL-22可能导致RA的炎症反应而发病[17]。本研究通过构建胶原诱导型关节炎大鼠模型,进一步观察壮药龙钻通痹方干预RA大鼠模型的足跖容积变化,踝关节组织病理改变和对Th22细胞水平与其效应因子IL-22的影响。结果显示:壮药龙钻通痹方高剂量组显著减小胶原诱导型关节炎模型大鼠的足跖容积,降低踝关节炎症细胞浸润,下调胶原诱导型关节炎模型大鼠Th22细胞水平与其效应因子IL-22的表达水平。初步结果显示,壮药龙钻通痹方可能通过抑制Th22细胞以及Th22细胞分泌因子IL-22的产生水平治疗RA,然而具体机制有待进一步研究。

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(收稿日期:2020-07-02 编辑:程鹏飞)

基金项目:国家自然科学基金面上项目(编号:81973976);广西中医药大学校级科研项目(编号:2017MS021);广西本科高校特色专业及实验实训教学基地(中心)建设项目(壮医学专业)(编号:桂教高教[2018]52号) 。

作者简介:张青槐(1980-),男,汉族,硕士,副教授,研究方向为壮医药基础和应用研究。E-mail:57382826@qq.com

通信作者:高慧(1986-),女,汉族,博士,讲师,研究方向为中医、壮医药基础和应用研究。E-mail:qhghzsybd@163.com

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