水体磷代谢转化中磷酸激酶基因研究进展

丁一

摘要：水体富营养化，藻类爆发是我国湖库亟待解决的主要水质问题之一，作为藻类生长的主要营养盐和制约因素，磷是水体富营养化的限制性诱因。在磷的代谢转化过程中，多聚磷酸盐（Poly-P）可将众多无机磷酸盐单体聚合。磷酸激酶（PPK）与Poly-P代谢密切相关。因此，对磷酸激酶基因PPK进行研究十分必要。

Abstract： Eutrophication is one of the main water quality problems for lakes and reservoirs in China. As the main nutrients of algae， the input of phosphorus is the main inducement of eutrophication. Polyphosphate （Poly-P） can polymerize many inorganic phosphate monomers in the process of phosphorus metabolism. Therefore， it is very necessary to study the PPK gene which is closely related to Poly-P metabolism.

关键词：磷酸激酶基因;缺失;克隆;除磷;环境因素

Key words： phosphokinase gene;missing;cloning;phosphorus removal;environmental factors

中图分类号：X703                                       文献标识码：A                                  文章编号：1006-4311（2020）02-0270-02

0  引言

水体富营养化，藻类爆发是我国湖库亟待解决的主要水质问题之一。2011年，26个国控重点湖泊（水库）中，富营养状态占53.8%。富营养化趋势逐年增长，作为藻类生长的主要营养盐和制约因素，磷既是主要污染指标，也是水体富营养化的限制性诱因。水体中磷含量增加，藻类将大量繁殖，影响湖库生态平衡、威胁人体健康和社会稳定。控制水中磷含量是抑制藻类生长，阻止富营养化发生的重要手段。

微生物可通过其种群结构变化和功能代谢活动改变磷的循环转化，影响上覆水体水质。此外，上覆水中的磷素又可凭借自然沉降、季节性返混等方式传输至沉积物，为微生物提供营养，改变其种类、数量和代谢。所以，微生物既是磷迁移转化的执行者，也是湖库营养元素的储存库和反馈者。系统研究微生对磷循环转化过程的作用与影响，对于掌握内源磷释放规律，抑制磷释放提供理论指导和科学依据。

聚磷酸盐自从前生物时代起就已被发现存在于自然界的生物中，如古细菌、细菌、原生菌、真菌、植物和動物。多聚磷酸盐在微生物中可占细胞干重的10%，在三磷酸腺苷（ATP）发现之前，被认为是能量的分配者。线状或环状多聚物多聚磷酸盐是由激酶催化的高能供体上的磷酸盐残基向Poly-P链上转化反应而形成，将多个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合。PPK与Poly-P代谢密切相关，通过催化ATP末端磷酸基团可逆地转移到长链Poly-P上，形成长度一千甚至更长的正磷酸盐线状或环状多聚物。PPK是生物累积利用环境中磷酸盐生成多聚磷酸盐的催化剂。许多自然微生物本身即具有聚集磷的能力，但作用效果有限。大量文献表明，PPK基因过度表达的微生物能过量的吸收环境中的磷酸盐，环境中的磷就会降低或去除。工程菌除磷能力较野生型大大提高，细胞也能更广泛的聚磷。因此，探明细菌磷酸盐转化、代谢生化机制和遗传特征，有助于提高聚磷菌从水中去除磷酸盐能力。

1  多聚磷酸盐分类

在PPK家族中包含多种子族，PPK1在细菌中非常保守，最初由大肠杆菌分离出来，催化ATP末端的磷合成Poly-P的可逆反应。但是有时，在好养异养硝化菌中，PPK1[1]往往只催化Poly-P的合成而不进行Poly-P的分解。

PPK2[2]分为三个子族，I级和II级PPK2分别催化二磷酸核苷和一磷酸核苷磷酸化。III级PPK2可以从AMP和聚磷酸盐中合成ATP。PPK2聚磷时可以使用GTP或者ATP作为底物，而PPK1严格使用ATP为底物。在利用Poly-P作为核苷二磷酸的供体时，PPK2更倾向于GDP而不是ADP。

PPK3[3]是一种使用无机多聚磷酸盐作为供体将CDP转化为CTP的酶。在分子量，肽序列相似性，物理性质，丝状结构方面类似于肌动蛋白家族。在PPK3突变体中，由于观察到蛋白质降解和膜检索是不耦合的，推测PPK3突变体的溶酶体扩大是由于成熟溶酶体的膜检索缺陷所致。这些都显示了PPK3在发育和生理功能中具有重要作用。

存在于VCT复合体中的PPK4参与Poly-P的跨膜运输[4]，如何利用PPK4提高Poly-P的跨膜运输速率也可以作为一个研究方向。如何整体提高除磷效果，既要考虑微生物的生长活性，也要考虑起主要作用酶的表达以及磷进出细胞的过程控制，综合考量，以达到更好的效果。

由上述PPK家族成员，我们可以看出，PPK1是Poly-P合成的关键基因，其表达量的高低直接影响聚磷菌聚磷能力的强弱。如何整体提高除磷效果，既要考虑微生物的生长活性，也要考虑起主要作用酶的表达以及磷进出细胞的过程控制，综合考量，以达到更好的效果。

2  PPK对微生物影响

在一定条件下，多聚磷酸盐驱动核苷酸磷酸化对微生物细胞的生存很重要。细菌细胞内poly-p水平较低，在应对各种压力条件下，显现出生物膜的形成，群体感应，运动性，以及其他毒性属性的缺陷。Poly-P可增强细胞抵抗外界恶劣环境能力，促进孢子及生物膜形成，提高捕食能力，增强细菌毒性等[5]。

PPK1能成为药物的靶点，在细菌病原体中，针对PPK1的表达，能成为具有潜在的抗菌药物设计目标，因为它减少了细菌的毒性和持久性，同时增加了对抗生素的敏感性。类鼻疽伯克霍尔德菌PPK突变体在氧化应激条件下易受过氧化氢的影响，无法进行游泳、聚集运动，比野生型菌株具有较低密度的生物膜形成能力[6]。研究人员在一些实验中将PPK基因敲除。在ShuminTan对幽门菌菌株的研究中，不激活PPK1致使聚磷量较预期减少超过250倍，几乎没有聚磷[7]。管莉菠等人克隆了PPK基因，构建多聚磷酸盐激酶表达菌株，磷的去除率达到80%。PPK基因在E.coli中的过量表达，致使E.coli菌体中Poly-P大量聚集，从而使培养基中的磷酸盐大量去除[8]。由此，可以看出PPK对微生物聚磷的重要作用。

3  自然环境对PPK表达的影响

PPK对除磷效果影响巨大，除了敲除和克隆，自然环境条件也会对PPK的表达产生影响，从而影响聚磷。

研究表明PPK活性随温度变化而变化，不具有规律性。但也有实验指出随着温度的升高，聚磷菌细胞内PPK 的活性持续增大。在张超等人的研究中，聚磷酸激酶的活性随着pH的增加而线性增加，并且聚磷菌的产率与聚磷酸盐激酶活性分别呈线性关系。在低浓度ZnO NPs作用下，PPK酶活与空白组相差不大。然而，高浓度ZnO NPs作用下，PPK酶活明显低于空白组。在任世英等人的研究中，碳源丰富，磷酸盐含量高，聚磷积累，PPK活性好。这说明了PPK活性受多种因素调节，单一环境变化并不一定会改变PPK活性，显示出PPK调节的复杂性。

4  结束语

在实际污废水除磷、水生态环境修复等实践中，相对于PPK的敲除与克隆，改变或者说强化有利的环境条件更容易实现，对于提高水体除磷效果具有更强的可实际操作性。因此，加强环境条件变化对PPK表达影响方面的研究具有极强的实践指导意义。

参考文献：

[1]Trelstad P.L.， Purdhani P.， Geissd？觟rfer W.， et al. Polyphosphate kinase of Acinetobacter sp. strain ADP1： purification and characterization of the enzyme and its role during changes in extracellular phosphate levels[J]. Appl Environ Microbiol， 1999， 65（9）： 3780-3786.

[2]Nocek B.， Kochinyan S.， Proudfoot M.， et al. Polyphosphate-dependent synthesis of ATP and ADP by the family-2 polyphosphate kinases in bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008， 2008 v.105 no.46（no. 46）： pp. 17730-17735.

[3]Gómez-García M.R.， Kornberg A. Formation of an actin-like filament concurrent with the enzymatic synthesis of inorganic polyphosphate[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（45）： 15876-15880.

[4]Hothorn M.， Neumann H.， Lenherr E.D.， et al. Catalytic core of a membrane-associated eukaryotic polyphosphate polymerase[J]. Science， 2009， 324（5926）： 513-516.

[5]Brown M.R.W.， Kornberg A. Inorganic polyphosphate in the origin and survival of species[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（46）： 16085-16087.

[6]Tunpiboonsak S.， Mongkolrob R.， Kitudomsub K.， et al. Role of a Burkholderia pseudomallei polyphosphate kinase in an oxidative stress response， motilities， and biofilm formation[J]. The Journal of Microbiology， 2010， 48（1）： 63-70.

[7]Tan S.， Fraley C.D.， Zhang M.， et al. Diverse phenotypes resulting from polyphosphate kinase gene （ppk1） inactivation in different strains of Helicobacter pylori[J]. J Bacteriol， 2005， 187（22）： 7687-7695.

[8]管莉菠，蔡天明，李波，等.Pseudomonas putida GM6多聚磷酸鹽激酶（ppk）基因的克隆及表达[J].土壤学报，2007：727-733.