宫颈HPV持续感染患者脱落细胞中miR-148a-3p的表达水平及意义

曹作增 张 蕾

宫颈癌是女性常见的妇科恶性肿瘤，其发病率和死亡率仅次于乳腺癌。宫颈癌发病具有长期的癌前病变阶段，在此病变过程中宫颈人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持续感染起决定性作用。研究[1-2]发现，大约80%的女性在50岁前曾感染过HPV，其中绝大部分会被机体的免疫系统自动清除，只有少部分HPV持续感染的女性才可能发生癌前病变，甚至发展为宫颈癌，严重威胁女性的生命健康。目前，通过早期筛查HPV持续感染女性可有效预防宫颈癌前病变及宫颈癌的发生。因此，寻找能客观反映HPV持续感染的相关因子至关重要，以利于早期癌前病变防治及宫颈癌的发生、发展。相关研究[3-4]报道，微小RNA(microRNA，miRNA)参与多种疾病的发展进程，其在肿瘤发生的各个环节均扮演着重要角色。微小RNA-148a-3p(microRNA-148a-3p，miR-148a-3p)是miRNA中重要一员，其水平异常表达与乳腺癌的相关关系研究较多[5]，而与宫颈HPV持续感染的关系研究较少。因此，本研究通过检测宫颈HPV持续感染患者脱落细胞中miR-148a-3p的表达水平，旨在评估miR-148a-3p与宫颈HPV持续感染的可能关系，并分析其对宫颈HPV持续感染的诊断价值。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年3月至2019年3月上海交通大学附属新华医院崇明分院妇科收治的宫颈HPV阳性患者170例作为研究对象，其中年龄27～60岁，平均(45.12±9.08)岁。纳入标准：①均经宫颈HPV分型检测及液基细胞学检查为阳性；②入院前未经治疗；③有正常性生活；④临床资料齐全。排除标准：①既往无宫颈病变史者；②妊娠期患者；③合并免疫系统疾病者；④不具备随访条件者。170例患者随访期间未接受任何治疗，根据随访6个月的结果将患者分为HPV非持续感染组(n=105，HPV转阴)、HPV持续感染组(n=65，HPV仍呈阳性)。本研究经本院伦理委员会审批通过，且患者均自愿签署《知情同意书》。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 采用问卷调查表方式收集两组患者年龄、吸烟史、受教育程度、初次性生活年龄、性伴侣数、人流次数及生殖道炎症情况。

1.2.2 宫颈脱落细胞中miR-148a-3p表达水平检测 两组患者均在非月经期采用一次性宫颈刷收集宫颈口处脱落细胞，取出后置于含细胞保存液的样品管中，4℃冰箱保存备用，于1周内集中检测。

采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测宫颈脱落细胞中miR-148a-3p表达水平。采用Trizol法(试剂盒购自江苏恩莫阿赛生物技术有限公司)提取宫颈脱落细胞中总RNA，并按逆转录试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)中方法将总RNA逆转录成cDNA。引物均由南京信帆生物技术有限公司合成，内参为U6。miR-148a-3p正向引物为5’-GCTAGCCTCCGAAGCAAACAATGAAA-3’，反向引物为5’-AAGCTTCGTCTACAAGGACTAACCGAAA-3’；U6正向引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反应条件为95℃、5 min，95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、40 s，共35个循环。重复3次，并通过2-ΔΔCt法计算宫颈脱落细胞中miR-148a-3p相对表达量。

1.2.3 HPV分型检测 采用广东凯普生物科技股份有限公司生产的HPV核酸扩增分型检测试剂盒，对21种常见的HPV基因型进行分型检测，其中6种低危型为6、11、42、43、44、81，作为低危型组(n=26)；15种高危型为16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68，作为高危型组(n=39)。

1.3 观察指标 记录并比较两组患者及高危、低危组HPV持续感染患者的miR-148a-3p表达水平，并分析影响宫颈HPV持续感染的危险因素。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较 两组患者吸烟、受教育程度及性伴侣数情况相比，差异均无统计学意义(P>0.05)；HPV持续感染组年龄≥45岁、初次性生活年龄<20岁、人流次数≥1次及有生殖道炎症比例均高于HPV持续感染组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者临床资料比较 [例(%)]

2.2 两组患者脱落细胞中miR-148a-3p表达水平比较 HPV持续感染组患者脱落细胞中miR-148a-3p表达水平为(0.59±0.15),低于HPV非持续感染组患者(1.01±0.26)，差异有统计学意义(t=11.852，P<0.001)。

2.3 低危型和高危型宫颈HPV持续感染患者脱落细胞中miR-148a-3p表达水平比较 高危型宫颈HPV持续感染患者脱落细胞中miR-148a-3p表达水平为(0.42±0.11),低于低危型宫颈HPV持续感染患者(0.67±0.18)，差异有统计学意义(t=6.955，P<0.001)。

2.4 影响宫颈HPV持续感染的危险因素分析 以宫颈HPV感染是否持续发生(是=0，否=1)为因变量，以上述两组临床资料比较具有统计学意义的因素纳为自变量(年龄、初次性生活年龄、人流次数、生殖道炎症及脱落细胞中miR-148a-3p表达水平)进行多因素logistic回归分析，具体赋值见表2。结果显示年龄、人流次数及脱落细胞中miR-148a-3p表达水平均是影响宫颈HPV持续感染的独立危险因素(P<0.05)，而初次性生活年龄、生殖道炎症与宫颈HPV持续感染无独立相关性(P>0.05)。见表3。

表2 自变量赋值情况表

表3 影响宫颈HPV持续感染的危险因素分析

2.5 脱落细胞中miR-148a-3p表达水平对宫颈HPV持续感染的诊断价值 脱落细胞中miR-148a-3p表达水平诊断宫颈HPV持续感染的曲线下面积为0.923(95%CI为：0.878～0.968)，最佳截断值为0.75，其诊断敏感度为81.30%，特异度高达96.30%。见图1。

图1 脱落细胞中miR-148a-3p表达水平

3 讨论

目前研究[6]发现，HPV持续感染是宫颈癌前病变及宫颈癌发生、发展的重要因素，90%以上的宫颈癌患者伴有高危型HPV持续感染，与年龄、生活习惯等多种因素有关，随病情进展可能导致宫颈病变[7]。miRNA是一类广泛存在于真核细胞中的小片段非编码RNA，在转录后基因表达调控过程中起重要作用[8]。研究[9]表明，miRNA可作为促癌或抑癌基因参与妇科恶性肿瘤发生、发展。miR-148a-3p位于人染色体7p15.2，在病毒感染、肿瘤等疾病发生发展中均扮演着至关重要的角色[10]。曾菁莘等[11]研究发现，miR-148a-3p可通过调控细胞死亡调节因子(Bim)蛋白的表达，参与寻常型银屑病的发生、发展。另有多位学者研究[12-15]报道，miR-148a-3p在胃癌、宫颈癌、上皮性卵巢癌、乳腺癌等肿瘤均呈异常表达，参与肿瘤发生、发展。而其与宫颈HPV持续感染关系尚不清楚，为此，本研究分析宫颈HPV持续感染患者脱落细胞中miR-148a-3p的表达及意义。

本研究结果显示，年龄、初次性生活年龄、人流次数及生殖道炎症情况与宫颈HPV持续感染发生有关。HPV持续感染组患者脱落细胞中miR-148a-3p表达水平远低于HPV非持续感染组患者，与张波等[12]、Li等[13]、Wang等[14]、李杨等[15]研究结果类似，提示脱落细胞中miR-148a-3p表达水平降低，可能参与宫颈HPV持续感染发生。进一步研究发现，高危型宫颈HPV持续感染患者脱落细胞中miR-148a-3p表达水平远低于低危型宫颈HPV持续感染患者，提示脱落细胞中miR-148a-3p表达水平变化可能与宫颈HPV类型有关。多因素logistic回归分析发现，年龄、人流次数及脱落细胞中miR-148a-3p表达水平均是影响宫颈HPV持续感染的独立危险因素，提示除考虑患者年龄、人流次数外，临床检测脱落细胞中miR-148a-3p表达水平可能对早期判断宫颈HPV持续感染发生提供依据。此外，ROC曲线分析发现，脱落细胞中miR-148a-3p表达水平诊断宫颈HPV持续感染的曲线下面积为0.923，提示miR-148a-3p对宫颈HPV持续感染具有较高诊断价值，当其表达水平为0.75时，诊断特异度高达96.30%，临床可通过检测脱落细胞中miR-148a-3p表达，早期预测宫颈HPV持续感染发生情况。

综上所述，宫颈HPV持续感染患者脱落细胞中miR-148a-3p表达水平明显降低，其是影响宫颈HPV持续感染的独立危险因素，脱落细胞中miR-148a-3p表达水平有望作为判断宫颈HPV持续感染发生的重要分子标记物。临床应密切关注脱落细胞中miR-148a-3p表达水平降低患者，以期为早期防治宫颈HPV持续感染提供帮助。由于宫颈HPV持续感染发生与多种因素有关，可能影响本研究结果，因此应加大样本进一步研究。