IL-35 Th17/Treg失衡在系统性红斑狼疮中的表达与意义

宋广浩 沈 瀚 宁明哲

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种以多系统损害为表现的自身免疫性疾病，发病机制涉及众多免疫细胞与因子。目前研究[1]认为，淋巴细胞亚群分布改变参与SLE发病，CD4+T细胞的数量和功能异常是SLE患者T细胞免疫功能异常的重要原因。辅助性T细胞17(T helper cell 17, Th17)与调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)是CD4+T细胞接受不同的刺激信号分化而来，两者功能相互抑制，在体内保持平衡。白细胞介素-35(interleukin-35，IL-35)是新发现具有免疫抑制功能的细胞因子，与IL-12、IL-23、IL-27共同组成IL-12细胞因子家族[2]，对于维持Th17/Treg的平衡有重要的作用。研究[3]认为，SLE患者体内存在着Th17/Treg的失衡，但是关于IL-35在SLE中的作用报道较少。因此，本文旨在探究新发SLE患者IL-35与Th17/Treg平衡的关系，为SLE的诊治提供新的线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至4月在南京鼓楼医院就诊的54例新发SLE患者为研究对象，其中男性4例，女性50例，年龄19～67岁，平均 (39.0±13.3)岁。按照SLE疾病活动度[4](systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)分为，轻度活动组(SLEDAI：5～9)：26例，男性2例，女性24例，平均年龄(38.6±10.8)岁；中度活动组(SLEDAI:10～15)：10例，男性1例，女性9例，平均年龄(36.8±12.5)岁；重度活动组(SLEDAI：>15)：18例，男性1例，女性17例，平均年龄(40.3±12.7)岁。另外选取同时期我院体检中心健康体检者共30例，其中男性3例，女性27例，年龄21～63岁，平均年龄(37.4±12.6)岁。4组研究对象年龄、性别方面比较，差异无统计学意义[F=0.277，P=0.842；P=1.000*(使用Fisher确切概率法)]，具有可比性。

1.2 SLE患者纳入与排除标准 纳入标准：①符合《系统性红斑狼疮诊疗指南》[5]者；②未接受免疫治疗者；③患者病情处于活动期(SLEDAI≥5)。排除标准：①患有其它自身免疫性疾病；②近期急性感染者；③脑血管意外者；④肺结核者；⑤有精神疾病史；⑥糖尿病者；⑦恶性肿瘤者；⑧接受免疫治疗者。

1.3 SLE患者治疗 SLE患者按照《系统性红斑狼疮诊疗指南》[5]选择治疗方案，54例患者中有15例在规范治疗15 d后再次采血检测，初步分析治疗药物对患者体内IL-35、Th17 及Treg的影响。

1.4 方法

1.4.1 试剂与仪器 IL-35 ELISA检测试剂盒(购自上海酶联生物科技有限公司)，CD4、CD25、FoxP3、Th17流式抗体、细胞刺激剂、红细胞裂解液(购自BD公司)；细胞培养液(购自Hyclone公司)；Th17细胞固定剂与破膜剂、Treg 染色固定剂与破膜剂(购自Invitrogen公司)；细胞培养箱(购自Theromo Fisher 公司)，流式细胞仪(购自BD公司)。

1.4.2 IL-35血清含量检测 清晨空腹状态下抽取受试者外周静脉血5 mL，3 500 r/min离心10 min获得血清，严格按照IL-35 ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中IL-35的水平。

1.4.3 Th17、Treg细胞流式检测 另抽取EDTA抗凝血2 mL，预处理后使用流式细胞仪检测外周血Th17与Treg细胞占T细胞的比例。流式数据分析使用BD Cellquest 软件。

1.5 观察指标 ①比较4组研究对象血清IL-35含量，以及外周血Th17、Treg与Th17/Treg的表达变化。②比较SLE患者治疗前后上述指标的变化。

2 结果

2.1 4组研究对象IL-35、Th17和Treg水平比较 SLE患者组Th17细胞百分比、Th17/Treg比值均高于对照组，SLE患者组IL-35水平、Treg细胞百分比低于正常对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；SLE患者重度活动组Th17细胞百分比较中度活动组升高(P=0.040)，中度活动组较轻度活动组升高(P=0.031)； SLE重度活动组Treg细胞百分比较轻度活动组降低(P=0.012)，而重度与中度活动组、中度与轻度活动组相比差异无统计学意义(P=0.356；P=0.290)；SLE重度与中度活动组Th17/Treg比值较轻度活动组升高(P<0.001；P=0.024)，而重度与中度活动组相比差异无统计学意义(P=0.066)； SLE重度与中度活动组IL-35水平较轻度活动组降低(P<0.001；P<0.001),而重度与中度活动组比较，差异无统计学意义(P=0.097)。见表1。

表1 4组研究对象IL-35、Th17和Treg水平比较

2.2 IL-35与Treg 、Th17 、Th17/Treg和SLEDAI相关性分析 Pearson相关性分析显示，SLE患者IL-35水平与Treg细胞百分比呈显著的正相关性(r=0.373,P=0.006)；IL-35与Th17细胞百分比、Th17/Treg和SLEDAI呈显著的负相关性(r=-0.563,-0.480,-0.686,P<0.001)。见图1。

图1 IL-35与Treg 、Th17 、Th17/Treg和SLEDAI相关性分析

2.3 15例SLE患者治疗前后IL-35、Th17与Treg水平比较 15例SLE患者经过15 d有效治疗后IL-35与Treg表达较治疗前升高，Th17与Th17/Treg的表达较治疗前降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 SLE患者治疗前后IL-35、Th17与Treg水平比较

3 讨论

新型抑制性细胞因子IL-35属于IL-12家族，是α链(p35)与β链(Ebi3)组成的异质二聚体，通过Jak-STAT信号通路参与T细胞增殖与调节，发挥免疫抑制作用[2]，已有研究[6-7]发现，在不同的自身免疫性疾病中观察到患者外周血IL-35表达水平下降。本研究结果显示，新发SLE患者血清IL-35水平低于健康对照组，并且重度与中度活动组IL-35水平较轻度活动组降低，虽然重度活动组与中度活动组相比IL-35水平未见明显差异，但是相关性分析显示血清IL-35水平与SLEDAI相关，这说明低表达的IL-35可能参与SLE的形成。

本研究检测新发SLE 患者与健康对照组外周血 Th17/Treg 的表达情况，发现新发SLE 患者Th17的表达升高，Treg的表达降低，Th17/Treg表达升高，患者体内存在着Th17/Treg失衡。Th17细胞具有强大的促炎作用，能分泌多种细胞因子，招募炎性细胞浸润组织形成损伤。研究[8-9]证明，Th17细胞参与SLE的形成，而本研究分析发现不同活动组SLE患者Th17的表达均具有显著的差异性，患者的病情活动度增加，Th17的水平也升高。此外IL-35对 Th17 细胞具有重要的抑制作用，它可以上调IFN-γ来阻断 TGF-β与其受体结合，使TGF-β不能诱导RORγt，导致 Th17的分化受到抑制[10]；当缺失Ebi3 亚基时，影响Th17分化的关键转录因子表达水平增高[11]，推测新发SLE患者体内IL-35降低可能是Th17升高的原因之一。Treg细胞具有主动免疫的功能，通过多种途径杀伤其他免疫细胞，调节体内T细胞平衡，抑制免疫反应。机制研究[2,12]认为，Treg细胞是机体内IL-35的主要来源，分泌的IL-35可以刺激扩增 CD4+CD25-Teff 和 CD4+CD25+Treg细胞，是Treg细胞发挥最大抑制效应所必需。本研究结果显示，新发SLE患者Treg细胞含量降低，这与谭国珍等[13]研究结果一致，推测Treg细胞分泌IL-35水平下降与抑制T细胞作用减弱可能与SLE的形成有关。在不同的SLE活动组中，重度与中度活动组、中度与轻度活动组Treg表达水平比较差异无统计学意义，可能是因为SLE患者Treg细胞异常不仅表现在数量上的减少，更存在功能上的缺失。Treg 细胞分泌IL-35功能受阻，反馈机体生成更多的IL-35,可能是重度与中度活动组IL-35水平没有差异的原因。IL-35具有抑制Teff细胞活性和抑制Th17细胞分化的作用，对Treg细胞活性的调节至关重要。本研究显示，新发SLE患者Th17及Th17/Treg与患者的IL-35水平显著负相关，Treg与 IL-35水平显著正相关，提示低表达的IL-35可能不能有效的调控Th17/Treg平衡，导致Th17细胞与效应因子亢进，损伤组织，促进SLE的形成，但是具体的机制还需要进一步研究。此外本研究发现，新发SLE患者经过短暂治疗后IL-35与Treg表达较治疗前升高，Th17与Th17/Treg的表达较治疗前降低。另有学者[14]认为，接受长期治疗的SLE患者Treg细胞表达较健康者高。Cai等[15]研究发现,免疫治疗后SLE患者IL-35表达增强。激素与免疫抑制类药物可能通过某些机制上调Treg细胞与IL-35的表达，发挥保护作用，缓解了SLE患者的病情。这提示增强患者体内IL-35水平可能是治疗SLE的新思路。

综上所述，新发SLE患者体内低表达的IL-35可能破坏了Th17/Treg平衡机制，参与SLE的发生。IL-35表达与SLE病程严重程度相关，可以作为潜在的预测SLE病程活动指标。