人羊膜上皮细胞的分离、培养和鉴定

江蕾微，董 仙，叶 藤，刘 志，李远英，陆洪光

（贵州省人民医院，贵州 贵阳 550001）

近年来随着临床医疗领域不断进步，Apligraf VR、Dermagraft VR等各种组织工程皮肤均已在临床创面修复工作中发挥着重要作用。现阶段多以同种异体角质形成细胞作为组织工程皮肤种子细胞[1]，但诸多因素提示其应用效果欠佳，有研究认为羊膜上皮细胞(hAECs)作为种子细胞将有利于提高临床组织工程皮肤应用价值。hAECs具有向三个胚层分化可塑性[2]、表达生长因子（EGF、KGF、HGF）、抗炎和抗菌的细胞因子等优势，从而对促进创面愈合具有积极意义。hAECs相较于人类胚胎干细胞而言，由于前者未表达端粒酶，在对其移植时肿瘤形成风险较低[2]，hAECs具有较低的免疫源性因此提示在对其移植后免疫排斥发生率较低。此外由于羊膜属于产后废弃物，因此取材简单、易得性较优、无伦理学争议，利于临床推广。由上述可知，将hAECs应用于组织工程皮肤再生工作中具有重要的研究价值。基于此，本文将着重探讨分离、培养、鉴定人羊膜上皮细胞的方法，以期为今后临床开展相关工作提供有利参考依据，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM 培养基（低糖型）（Gibco，USA），EGF（PeproTech，USA），胎牛血清（Hyclone，USA），Oct-3/4抗体（SantaCruz，USA），SSEA-4抗体（SantaCruz，USA），超净工作台（苏州净化设备公司），CO2细胞培养箱（Thermo公司，3111型），倒置生物显微镜（OLYMPUS，CK40-F200），荧光显微镜及照相系统（Olympus 公司），台式离心机（上海安亭科学仪器厂，TDL-40B型）。

1.2 羊膜来源

羊膜组织来源于贵州医科大学产科，由健康足月产妇剖宫产手术成功分娩新生儿后留存的新鲜胎盘，通过对胎盘羊膜组织机械剥离使其尽量保持完整。本次研究内容通过本院医学伦理研究会审核批准，标本取材前均征得本人同意且签署相关协议（即医院伦理委员会拟定的知情同意协议）。

1.3 hAECs分离培养

羊膜上皮细胞(hAECs)提取方法为胰蛋白酶（低浓度）多步消化分离法,具体如下：①PBS对羊膜组织反复冲洗，之后剪为细碎小块待用；②组织中加入EDTA溶液（内含0.05%胰蛋白酶）并置入37℃环境下行10 min消化；③将消化液舍弃（即分离杂细胞、细胞碎片），重复消化30～40 min（条件同上）；④过滤（200目不锈钢网）收集单细胞悬液，将其加入培养基（内含10%FBS）终止消化；⑤再次过滤后重复消化1次（步骤同上）；⑥利用完全培养基（内含10 ng/ml EGF）对离心收集细胞培养，即放置于37℃、5%二氧化碳培养箱内；⑦首次换液为24 h，之后每间隔3 d换液1次（全量），10 d左右细胞可根据常规方法实现传代培养。

1.4 统计学分析

本文中计量、计数资料分别予以“±s”、n（%）形式体现，利用SPSS 26软件检验相关数据（方法t/2），以P＜0.05提示对比结果存统计学意义。

2 结 果

2.1 肉眼观察

由健康足月产妇剖宫产手术成功分娩新生儿后留存的新鲜胎盘剥离出厚度0.02～0.05 mm、透明、有韧性的羊膜组织。（见图1）。

2.2 hAECs、KCs形态特征（原代培养）

原代hAECs接种24 h后可见多数细胞贴壁，细胞刚贴壁时呈圆形、折光性强，之后其胞质逐渐展开且折光性下降。3～5 d细胞贴壁进入指数生长期，此时可见细胞数量显著增加、形态呈扁平多角形、核/浆比率较小的胞核则表现为圆形或卵圆形，6～8 d可见单层、细胞融合成片且表现出铺路石样，将其于显微镜下倒置观察可见最初接种表皮细胞中存在较多KCs、少量黑素细胞及成纤维细胞，利用差别胰酶对其处理留存较纯净KCs。差别胰酶处理后所得第2代KCs可见细胞融合、表现为典型上皮细胞铺路石样、呈克隆状生长，单个细胞具有清晰轮廓、呈圆形或多角形、折光性强。

2.3 hAECs来源特征（原代培养）

原代培养所得hAECs上皮细胞标记物经CKpan染色结果呈阳性，胞浆染色表现为棕褐色，苏木精衬染胞核表现为蓝紫色，提示培养所得细胞具有上皮特征。右图为KCs阳性对照组。hAECs CK18染色（简单原始上皮标志物）呈阳性、胞浆染色呈棕褐色、苏木精衬染胞核表现为蓝紫色，已成熟表皮细胞KCs中可见CK18染色呈阴性。

3 讨 论

实验研究中发现，hAECs较易分离培养，hAECs经过胰酶消化之后，原代细胞内有羊膜间充质细胞混杂其中，经传代培养后可实现逐渐纯化，hAECs具有典型上皮样形态（即铺路石样）。免疫组化可见hAECs广谱角蛋白、CK18染色呈阳性，提示其存在具有上皮细胞特征及向上皮分化潜能。hAECs表达胚胎干细胞表面标记物（即SSEA-4、OCT-4）,二者表达主要位于细胞高密度区、小克隆区、球体结构区，因此较为稀疏的hAECs区域多无表达。上述结果与Miki,T.等人研究一致。羊膜属于产后废弃物从而取材简单、无伦理学争议，加之hAECs易于分离、体外大量扩增且具有干细胞的特性，因此提示其属于较为理想的组织工程种子细胞之一。