间接免疫荧光法和实时荧光定量PCR对小儿肺炎支原体感染临床诊断价值的研究

2020-02-02吴婷娜内江市第一人民医院

保健文汇 2020年12期

文/吴婷娜（内江市第一人民医院）

肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae,MP）是呼吸道感染常见病原体[1]，支原体肺炎即原发性非典型肺炎，多发于学龄前儿童，经由呼吸道飞沫传播，其临床症状和体征不具有特异性，仅凭临床表现或影像学检查等难以与一般病毒或细菌感染相鉴别，容易漏诊而错失最佳治疗时机，因此，尽早诊断肺炎支原体感染至关重要。临床实验室肺炎支原体感染的检测方法包括血清学检测、微生物快速培养、分子生物学检测等，本研究回顾性分析63 例于我院诊断的小儿肺炎支原体感染患者的情况，所有患者均使用间接免疫荧光法检测肺炎支原体特异性IgM 抗体及实时荧光定量PCR 检测肺炎支原体DNA，通过分析检测结果，探讨两种检测方法对小儿肺炎支原体感染诊断的临床应用价值，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

对2019 年9 月-2020 年9 月收治入我院的63 例肺炎支原体感染患儿进行回顾性分析，所有患儿均符合《诸福棠实用儿科学》中支原体肺炎诊断标准。所有患儿均使用间接免疫荧光法检测血清肺炎支原体特异性IgM 抗体及实时荧光定量PCR 检测咽拭子/痰液肺炎支原体DNA。63 例患儿中，男性33 例，女性30 例；年龄1-11 岁，平均年龄（4.86±3.14）岁；病程2-30d，平均病程（9.52±8.58）d，病程<7d 者39 例，病程≥7d 者24 例。

1.2 仪器与试剂

Smart32 全自动核酸提取仪（中山大学达安基因股份有限公司）、DA7600 实时荧光定量PCR 仪（中山大学达安基因股份有限公司）、EUROStar Ⅲ Plus 荧光显微镜（德国欧蒙医学实验诊断有限公司）、肺炎支原体核酸检测试剂盒（PCR 荧光探针法）（中山大学达安基因股份有限公司）、呼吸道病原体谱抗体IgM 检测试剂盒（间接免疫荧光法）（德国欧蒙医学实验诊断有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

（1）血清：采集患儿的空腹静脉全血标本约2ml并及时分离出血清，2-8℃保存，24h 内完成。

（2）咽拭子：用咽拭子取咽部分泌物，将咽拭子植入无菌玻璃管，密封送检。

（3）痰液：使用一次性吸痰器，患儿取仰头平卧位，将吸痰管缓缓插入咽喉部，调节负压，将气管深部分泌物（在雾化吸入后效果较好）缓缓吸入储液瓶中，反复数次，储液瓶中分泌物即为标本，密封送检。

1.3.2 肺炎支原体特异性IgM 抗体检测

应用间接免疫荧光法检测肺炎支原体特异性IgM 抗体，荧光显微镜下观察到特异性的荧光模型判定为阳性。整个过程严格按照肺炎支原体特异性IgM 抗体检测标准操作规程和试剂盒使用说明书进行操作。

1.3.3 肺炎支原体DNA 检测

应用核酸提取试剂在核酸提取仪上对肺炎支原体的DNA 进行提取，随后使用PCR 试剂在PCR 扩增仪上进行扩增，扩增结束后对结果进行解读，增长曲线呈S 型曲线且Ct 值<40 判定为阳性。整个过程严格按照肺炎支原体核酸检测标准操作规程和试剂盒使用说明书进行操作。

1.3.4 观察指标

比较两种方法的肺炎支原体阳性检出率；分析两种方法在不同病程的阳性检出率情况。不同病程分别为病程<7d和病程≥7d。

1.4 统计学处理

采用SPSS19.0 软件进行统计学分析。计数资料以例数或百分率表示；A 组和B组阳性检出率的差异性用四格表资料的卡方检验进行分析，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法对肺炎支原体感染检测结果的比较

见表1。63 例患者中，实时荧光定量PCR 检出阳性48 例（76.19%），间接免疫荧光法检出阳性18 例（28.57%），前者阳性检出率高于后者，P<0.05，差异具有统计学意义。

2.2 不同病程肺炎支原体检出情况的比较

见表2。对于病程<7d 的患儿，实时荧光定量PCR 的阳性检出率为92.31%，明显高于间接免疫荧光法（7.69%），差异具有统计学意义。而对于病程≥7d 的患者，两种检测方法阳性检出率无显著性差异。

表1 两种检测方法诊断肺炎支原体结果比较[n(%)]

表2 不同病程诊断肺炎支原体结果比较[n（%）]

3 讨论

肺炎支原体是儿科常见的感染性病原体，有报道称肺炎支原体肺炎患儿可占住院肺炎患儿的40%[2]。小儿感染肺炎支原体后，由于其临床表现缺乏特异性，因此鉴别诊断并不容易，常常出现误诊或漏诊的情况[3]。该疾病病程可持续较长时间，且可发生较多肺外并发症[4]，但肺炎支原体对大环内酯类抗菌药物敏感[5]，因此，如果在感染初期得到有效诊断，对患儿的治疗则具有重大意义。本研究回顾性分析间接免疫荧光法与实时荧光定量PCR 对肺炎支原体感染的诊断价值，表1 表明实时荧光定量PCR 对肺炎支原体感染的阳性检出率明显高于间接免疫荧光法，一方面可能是由于PCR 方法的灵敏度及特异度较高，另一方面，48 例实时荧光定量PCR 检出阳性而抗体阴性的患者中，有9 例病程已接近1个月，Nilsson 等[6]报道，肺炎支原体急性感染患者喉部残留的DNA 片段可以存在较长时间，可持续45-52d，此时仍可从患者口咽部检测到残留的核酸片段，但特异性IgM 抗体可能已消退至无法检出。此外，抗体产生亦与年龄、病程、免疫功能等相关，如对于年龄较小的患者，其免疫系统发育尚不完全，可导致血清学检验产生假阴性现象[7]。表2 表明，两种检测方法阳性检出率与病程相关，对于病程<7d 的患者，DNA 检出阳性率高于特异性IgM 抗体，通常，IgM 抗体于感染1 周后出现，一般可持续3-4 周，因此，对于病程<7d 的患者，考虑其特异性IgM 抗体还未产生或其浓度低于检出限，而实时荧光定量PCR 由于其高灵敏度，可在病程早期检出肺炎支原体DNA。