中和稀释法在食品微生物检验中的应用探讨

石文松 吴泽君 贺 晶 罗雨阳 陈阳桔 胡 群

（湖南省株洲市食品药品检验所 湖南株洲 412000）

1 前言

防腐剂作为一种经济、方便、可有效防止食品腐败变质的添加剂，在食品行业中应用广泛[1]。 而防腐剂对食品微生物检验结果的影响也逐渐受到关注[2，3]。苯甲酸是生产中常见的防腐剂，探讨其对微生物检测结果的影响有助于评估样品微生物污染的实际状况。

2 材料与方法

2.1 材料与仪器

材料：某品牌果蔬饮料（标识未添加防腐剂）。卵磷脂、平板计数琼脂培养基（PCA）（广东环凯微生物科技有限公司）；磷酸氢二钠（AR）、磷酸二氢钾（AR）、盐酸（AR）、氢氧化钠（AR）、氯化钠（AR）（国药集团）；苯甲酸钠(含量99.5%）；吐温-80（含量99.5%）；金黄色葡萄球菌（CMCC（B）26003，中国食品药品检定研究院）。

仪器：高压蒸汽灭菌锅；二级生物安全柜；恒温培养箱；电子天平；电子比浊仪；冰箱。

2.2 方法

样品制备添加苯甲酸钠于该饮料中，使苯甲酸浓度分别为1.0、2.0、3.0、5.0 mg/mL。

稀释液制备：配制0.9%氯化钠溶液（稀释液1）；磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾：1.36 g/L、磷酸氢二钠：2.83 g/L）；含3%吐温-80 与0.3%卵磷脂的磷酸盐缓冲液（稀释液2）。

菌悬液制备：将接种于平板计数琼脂斜面上金黄葡萄球菌24 h 新鲜培养物（第3 代），用灭菌生理盐水配制菌悬液，测定浊度，再稀释至浓度约为1.5×103CFU/mL（菌悬液1）和3.7×105CFU/mL（菌悬液2）。

检验与数据处理各称取1.0mL 样品，分别加入9.0 mL 稀释液，混匀，作用5 min，再加入1 mL 菌悬液1，混匀，作为样品组1。 取样品各25 mL，分别加入1 mL 菌悬液2，混匀，室温条件下作用30 min，分别加入225 mL 的稀释液，混匀，作用5 min，作为样品组2。 取各样品组检测样溶液1.0 mL 检验菌落总数。 以等体积稀释液替代检测样依法加入菌悬液作为阳性对照，以各稀释液为空白对照，每组重复试验4 次，观察结果分析各组数据。

3 结果

3.1 样品组1 检测结果

样品组1 检测结果（各次试验菌落数均值）详见表1。

除苯甲酸浓度为3.0 mg/mL 和5.0 mg/mL 且以稀释剂1 处理的检测样外，其余检测样菌落数回收率均在90%～110%，误差率＜15.0%。

3.2 样品组2 检测结果

样品组2 检测结果，详见表2。

苯甲酸浓度为0、1、2 mg/mL，各检测样菌落数差异没有统计学意义；苯甲酸浓度为3、5 mg/mL 时，稀释剂1、稀释剂2 处理的样品菌落数差异有统计学意义，但稀释剂2 的检测结果相对接近苯甲酸浓度为0 mg/mL 的结果。

表1 样品组1 检测结果

表2 样品组2 检测结果

4 讨论

近年来，防腐剂的新品种不断被研究开发[4，5]，药品、化妆品等产品检验标准均规定了防腐剂对微生物项目检验结果影响的相应评估或消除、减弱的措施或方法[6]，食品也引起部分研究者的关注，并对其影响进行探索和评价[7]。 苯甲酸作为常见防腐剂，主要通过非选择性的抑制细胞呼吸酶系的活性（阻碍乙酰胺辅酶A 的缩合反应）以及改变细胞膜的通透性，干扰微生物的生长代谢[8]，其对微生物检验结果的影响需进一步探索。

研究中发现，以模拟样品为基质设计样品组，比较2 种稀释剂对苯甲酸的稀释中和作用，样品组1在其浓度≥3.0 mg/L 时，生理盐水的影响较弱，菌落回收率较低及组间误差率较大；以含吐温-80、卵磷脂及具缓冲作用稀释剂处理的菌落回收率较好，组间误差率较小。 组间误差率大于15%，则表示中和剂未达到很好的中和作用[9]，苯甲酸的抑菌作用并没有得到较好的控制。样品组2 的试验进一步说明，在其浓度为3.0 mg/L 和5.0 mg/L 时，不同稀释液处理样品的检测结果存在差别，稀释剂2 处理样品的检测结果更接近于微生物实际污染状况。 在稀释剂中添加吐温-80、卵磷脂，两者均为表面活性剂，可消除菌体和防腐剂的结合或在菌体形成保护膜，减少菌体损害。此外，防腐剂与杀菌剂在一定条件下可相互转化。 pH 越低苯甲酸杀菌效果越好，在酸性条件下，0.1%的含量也具有强效杀菌作用[10]。而具有较好缓冲能力的稀释剂可改变样品处理液的pH，使苯甲酸的抑菌能力减弱，间接减少其对微生物的生长抑制或损害。因此，对添加防腐剂的样品使用具有中和作用的稀释剂，可使检验结果更接近微生物污染的真实值。 尤其在不明确样品pH 或苯甲酸浓度的情况下，有利于减弱或降低微生物的生长抑制或损害，以及后续培养中菌体的自我修复与生长。