罗伊氏乳杆菌产罗伊氏细菌素的工艺优化

万心怡， 徐学明， 吴凤凤

（江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

罗伊氏乳杆菌 （Lactobacillus reutrei） 是美国FDA 认证的一种安全和健康的食品补充剂，广泛地存在于人、猪、家禽和其他动物的胃肠道中[1]。 在甘油溶液中，罗伊氏乳杆菌能转化甘油生产的罗伊氏细菌素（Reuterin）。 罗伊氏细菌素是一种由3-羟基丙醛的单体、水合物和环状二聚物混合组成的天然广谱抑菌物质，在水溶液中存在动态平衡[2]。 罗伊氏细菌素能有效抑制革兰氏阴性菌、阳性菌、酵母菌、霉菌和原生动物的生长[3]，可作为抑菌剂[4-7]、抗感染治疗剂[8-10]、生物交联剂[11]、新型生物材料[12]等。 目前已知能转化甘油生成罗伊氏细菌素的微生物主要是杆菌属（Bacillus），克雷伯菌属（Klebsiella），柠檬菌属（Citrobacter），肠杆菌属（Enterobacter），梭菌属（Clostridium）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）[13-17]。其中Klebsiella pneumonia和L. reuteri具有较高转化甘油生产罗伊氏细菌素的能力， 是研究较多的菌株。有研究指出： 在纯的甘油溶液中，L. reuteri是已知微生物中产罗伊氏细菌素最强的菌株[3]。

目前利用L.reuteri生产罗伊氏细菌素的产量普遍小于150 mmol/L[8，18-20]。 Lüthi-Peng 等人在厌氧的条件下， 利用L.reuteri细胞转化200 mmol/L 甘油生成170 mmol/L 的罗伊氏细菌素[21]，这是已有报道中较高的产量，但仍然达不到工业生产的要求。 由于罗伊氏细菌素对细胞有毒害作用， 限制了体外高浓度的积累。 许多研究者在转化过程中添加氨基脲[22-23]、亚硫酸氢钠[24-25]，能有效降低这种影响，使罗伊氏细菌素在体外较高浓度积累，但这些方法也增加了产物分离纯化的难度。 本研究旨在优化L.reuteri生产罗伊氏细菌素的条件，提高罗伊氏细菌素的生产效率和产量，为今后大规模的工业化生产提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

辅酶CoB12和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物（MBTH）：购于Sigma 公司；蛋白胨和酵母粉：购于Oxoid 公司；其他试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

Shimadzu 高效液相色谱仪（LC-20AT）；DWS 厌氧培养箱； 北京普析紫外/可见分光光度计 （TU-1900）； 上海之信细胞破碎仪 （JYD-990L）；Thermo高速离心机。

1.2 静息细胞的制备

细胞的制备方法参照Axelsson 等人[4]并有稍许修 改。 罗 伊 氏 乳 杆 菌 （Lactobacillus reuteri）ATCC53608 在MRS 培养基 （蛋白胨1%， 牛肉膏1%，酵母粉0.4%，葡萄糖2%，硫酸镁0.02%，乙酸钠0.5%，柠檬酸三胺0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸锰0.005%，吐温80 0.1%）中37 ℃静置过夜培养活化。 活化两次后的种子液以6%的接种体积分数接种到MRS 培养基中， 厌氧条件下静置发酵培养24 h。发酵后的菌悬液经5 000 r/min 离心10 min，并用磷酸缓冲液（pH 7.0）冲洗一次，以收集湿细胞。

1.3 罗伊氏细菌素的制备

将收集的湿细胞加入到7 mL 已灭菌的甘油溶液（100~500 mmol/L）中，在不同的设定温度（20~50 ℃）中厌氧静置培养（0.5~5 h）。 菌悬液经10 000 r/min离心5 min，获得的上清液在4 ℃下保存。

1.4 罗伊氏细菌素的检测

罗伊氏细菌素的检测方法参照Circle 等人[26]的方法。 由于罗伊氏细菌素没有标品，而罗伊氏细菌素在酸性条件下能脱水生成丙烯醛，丙烯醛在浓盐酸的作用下可与色氨酸进行缩合反应，生成紫色化合物，其最大吸收峰在560 nm 处。 因此可以用比色的方法来检测罗伊氏细菌素的含量， 并且1 mol 的罗伊氏细菌素反应后生产1 mol 的丙烯醛， 故用丙烯醛标准品配置成0~0.7 mmol/L 的溶液，绘制标准曲线。 样品检测时，在10 mL 的离心管中加入1 mL的样品、0.75 mL 的色氨酸试剂、3 mL 的浓盐酸混匀，37 ℃下保温20 min 后检测在OD560的吸光值。

1.5 甘油脱水酶酶活的检测

细胞悬浮液置于冰浴中超声细胞破碎 （功率300 W，破壁1 s，间歇3 s，重复300 次）。 破碎后于4 ℃条件下10 000 r/min 离心5 min，上清液即为粗酶液。 甘油脱水酶活力的检测方法参照Toraya 等人[27]的3-甲基-2-苯并咪唑腙法。 甘油在甘油脱水酶的作用下生成3-羟基丙醛， 生成的3-羟基丙醛与3-甲基-2-苯并咪唑腙（MBTH）反应生成腙类化合物，因此可以用比色的方法来检测。 在5 mL 的离心管中加入100 μL 的2 mol/L 1，2-丙二醇，100 μL 的0.5 mol/L KCl，10 μL 的1.5 mmol/L 辅 酶B12，690 μL 的50 mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH 7.0），100 μL 的粗酶液，37 ℃保温10 min。 加入1 mL 的0.1 mol/L柠檬酸钾缓冲液（pH 3.6）终止反应，再加入0.5 mL的新配0.1%MBTH，37 ℃保温15 min。 最后加入1 mL 的蒸馏水，混合均匀后在305 nm 处测吸光值。 1个酶活单位定义为： 在37 ℃、pH 7.0 条件下，1 min催化生成1 μmol 丙醛所需的酶量。

粗酶液蛋白质含量测定方法参照Bradford 法[28]，以牛血清蛋白为标品。

1.6 甘油浓度的检测

甘油浓度通过高效液相色谱检测， 色谱条件为：ZORBAX NH2柱，柱温30 ℃，流动相乙腈∶水=9∶1（V/V），流速1 mL/min，示差折光检测器。 样品检测前用0.45 μm 微孔滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 菌龄对罗伊氏细菌素产量的影响

处于不同菌龄的细胞，它的生理状态有一定的差异，这会显著影响L. reuteri细胞内甘油脱水酶的酶活。如图1 所示，在厌氧发酵的早期阶段，L.reuteri细胞内甘油脱水酶的酶活非常低，14 h 后酶活显著增加。当细胞处于稳定期初期（26 h），细胞内甘油脱水酶的酶活达到最大2.2 U/mg，之后稳定在2 U/mg左右。 因此，使用稳定期初期的细胞用于酶转化，有利于提高罗伊氏细菌素的产量，这与Stevens 等人[24]的研究结果类似。

图1 菌龄对罗伊氏细菌素产量的影响Fig. 1 Effects of cells age on the reuterin production

2.2 缓冲溶液浓度和pH 对罗伊氏细菌素产量的影响

不同离子浓度会影响微生物的生理活性，因此研究不同缓冲溶液浓度对罗伊氏乳杆菌生产罗伊氏细菌素的影响。 如图2（a）所示，以不同浓度的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾（PBS）作为甘油溶液的缓冲体系，控制pH 稳定在6.0。 随着缓冲溶液浓度的增加，罗伊氏细菌素的产量显著增加。 当缓冲溶液浓度为0.08 mol/L 时，产量达到峰值。当浓度超过0.2 mol/L 后，罗伊氏细菌素浓度急剧下降。 这是因为当缓冲溶液浓度较低时，缓冲稳定性相对较差，甘油溶液pH 不能稳定在最适值； 当缓冲溶液浓度超过0.08 mol/L 后，细胞有一定的自我调节能力，而超过一定浓度后，溶液中离子强度过高，影响细胞的生理活性，细胞转化能力急剧下降。

pH 值能显著影响罗伊氏乳杆菌内甘油脱水酶的活性， 不同微生物来源的甘油脱水酶的最适pH差异较大。 肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）和弗劳地枸橼酸杆菌（C.freundiiDSM 30040）来源的甘油脱水酶，其最适pH 为8.5[29-31]。与其他来源的甘油脱水酶相比，L. reuteri来源的甘油脱水酶的最适pH 偏低。 马会亮等人研究发现罗伊氏乳杆菌（L. reuteriCG001）中的甘油脱水酶最适pH 在6.2 左右[32]。 因此研究了不同pH 值对L. reuteri生产罗伊氏细菌素的影响， 并比较了用缓冲溶液控制恒定pH 和只调节初始pH 的差异。分别利用磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲体系控制甘油溶液保持不同的恒定pH，以及用HCl、NaOH 把甘油溶液配置成不同的初始pH。分别检测酶转化1 h 后罗伊氏细菌素产量。如图2（b）所示，在两种不同的pH 调节方式下，当pH 6 时罗伊氏细菌素的产量都表现为最大值。 并且在弱酸的条件下，有利于L.reuteri生产罗伊氏细菌素。

图2 不同缓冲溶液浓度和pH 对罗伊氏细菌素产量的影响Fig. 2 Effects ofbuffer concentration and pH on the reuterin production

2.3 甘油浓度对罗伊氏细菌素产量的影响

甘油作为催化反应的底物，其浓度对罗伊氏细菌素产量有显著影响。 作者研究了不同浓度的甘油作为底物，催化1 h 后罗伊氏细菌素的产量，见图3。甘油浓度低于300 mmol/L 时，罗伊氏细菌素的产量随着甘油浓度的增加而增加，甘油转化为罗伊氏细菌素的比例（甘油转化率）均在50%以上。 之后随着甘油浓度再增加，产量逐渐降低。 实验表明，在一定范围内增加甘油浓度有利于罗伊氏细菌素产量的提高，由于甘油是罗伊氏乳杆菌的自杀底物，过高的甘油浓度会抑制菌体的生长。 因此，静置培养时，300 mmol/L 的甘油浓度是最适合的底物浓度，同时在实际生产时可以采取流加甘油的形式，使甘油浓度维持在一定范围，从而降低甘油对菌体的抑制作用。

图3 甘油浓度对罗伊氏细菌素产量的影响Fig. 3 Effect of glycerol concentration on the reuterin production

2.4 酶转化时间对罗伊氏细菌素产量的影响

罗伊氏乳杆菌体内存在代谢甘油的还原途径[3，33]。甘油经依赖辅酶B12的甘油脱水酶转化为罗伊氏细菌素[30，34]，再经依赖NAD+的1，3-丙二醇脱氢酶转化为1，3-丙二醇[35-37]。 罗伊氏细菌素是甘油两步代谢的中间产物，酶转化时间能影响罗伊氏细菌素和副产物1，3-丙二醇的产量。 如图4 所示，随着时间的增加，罗伊氏细菌素的产量显著增加，在1 h 后达到最大值154 mmol/L，之后随着反应时间的延长产量逐渐降低。 由于甘油转化成罗伊氏细菌素的途径中，需要依赖辅酶B12的甘油脱水酶的催化，并且在催化的同时，辅酶B12的C-Co 键由于底物甘油的作用， 发生不可逆的断裂形成5’-脱氧腺苷和烷基钴氨素类似物，而甘油脱水酶与形成的烷基钴氨素结合，致使甘油脱水酶失活[38]。推测随着发酵时间的延长，胞内的甘油脱水酶由于甘油的自杀抑制作用逐渐失活。 1 h 后大部分的甘油脱水酶失活，这时细胞不再能转化甘油，而胞内还残留有NADH，罗伊氏细菌素经依赖NADH 的1，3-丙二醇脱氢酶继续转化形成1，3-丙二醇；或是能转化少量甘油，但产生罗伊氏细菌素的量低于罗伊氏细菌素反应生成1，3-丙二醇的量，这都能使得检测到的罗伊氏细菌素浓度降低。

2.5 接种量对罗伊氏细菌素产量的影响

甘油脱水酶作为反应的关键限速酶，其浓度直接决定催化反应速率。 在酶转化过程中，反应速率表现为甘油溶液中的细胞浓度。 如图5 所示，接种量从20 mg/mL 增加到80 mg/mL 时，罗伊氏细菌素产量呈线性增加； 接种量超过100 mg/mL 之后，随着接种量的增加， 罗伊氏细菌素的产量反而减少。这可能是因为细胞浓度过高，细胞与甘油的接触比表面积减小，导致传质阻力增大而酶转化速率下降。

图4 发酵时间对罗伊氏细菌素产量的影响Fig. 4 Effect of enzyme conversion time on the reuterin production

图5 接种量对罗伊氏细菌素产量的影响Fig. 5 Effect of cell concentration on the reuterin production

2.6 温度对罗伊氏细菌素产量的影响

温度不仅能影响细胞内甘油脱水酶的酶活，还能影响罗伊氏细菌素对细胞的毒害作用[20]，因此设置不同温度，观察温度对细胞产罗伊氏细菌素的影响。图6 表明，30 ℃时罗伊氏细菌素的产量最大，同时在较低的温度下（20 ℃），还能保持较高的罗伊氏细菌的产量， 推测低温有利于罗伊氏细菌素的积累。 此结果不同于Chen 等人报道的罗伊氏乳杆菌酶转化的最佳温度为37 ℃， 以及温度对酶转化影响的规律[18]，但与Doleyres 等人研究的温度对罗伊氏乳杆菌ATCC 53608 的影响结果相似[20]。

图6 温度对罗伊氏细菌素产量的影响Fig. 6 Effect of temperature on the reuterin production

2.7 正交实验优化

在单因素实验的基础上，采用L16（45）正交表设计实验，研究了缓冲溶液pH 值、甘油浓度、酶转化时间、接种量、温度对罗伊氏细菌素产量的影响，实验安排及结果见表1-2。

由表2 可以看出，实验的5 个因素对罗伊氏细菌素的产量都有极显著影响（P＜0.01），影响罗伊氏细菌素产量因素的主次排序依次是：B（甘油浓度）＞D（接种量）＞C（时间）＞E（温度）＞A（pH）。根据多重比较确定各因素的最佳水平组合为B4D4C4E3A4， 其中A3和A4无显著性差异。 考虑到甘油脱水酶的最适pH 为6.2， 为了节约在实际应用中控制pH 使用的碱液的量，最佳pH 定为6.2。因此，全细胞转化生产罗伊氏细菌素的最佳条件为：甘油浓度400 mmol/L，接种量110 g/L，酶转化时间120 min，温度30 ℃，发酵pH 6.2。

对最佳条件进行验证试验，6 次独立重复实验，罗伊氏细菌素平均产量达到（241.2±3.4） mmol/L，较单因素实验中最佳产量提高了30%。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factor level of orthogonal design

表2 方差分析表Table 2 Analysis of variance for the orthogonal design

3 结 语

研究发现，处于稳定期初期的L. reuteri，其细胞内甘油脱水酶的酶活最大，有利于转化甘油生产罗伊氏细菌素。 通过单因素和正交实验的优化，L.reuteri转化甘油生产罗伊氏细菌素的产量达到了（241.2±3.4） mmol/L，生产的效率和产量得到了显著提高，为今后大规模的工业化生产提供一定的指导。