滇结香花提取物组分1（Fr.1）对C2C12肌细胞胰岛素抵抗的改善作用

孟照敏， 耿 燕*， 李 恒， 许泓瑜， 许正宏，2， 赵 辉， 刘 敏， 史劲松

（1. 江南大学 药学院， 江苏 无锡2141222；2. 江南大学 生物工程学院 江苏 无锡214122；3. 青藏高原微生物国家地方联合工程研究中心 西藏 拉萨850000）

胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）是Ⅱ型糖尿病发生和发展的关键驱动性因素，也是引起一系列代谢疾病如冠心病、高脂血症、高血压等共同的病理生理基础[1]。 其主要表现为靶细胞对胰岛素的敏感性和 （或） 反应性降低， 即正常剂量的胰岛素（Insulin，Ins） 产生低于正常生物学效应的一种状态，主要发生在肝脏、骨骼肌和脂肪组织，在肝脏中通过抑制糖原分解和糖异生来降低肝脏葡萄糖输出的能力，在脂肪、骨骼肌组织中表现为摄取葡萄糖并将其利用或存储的能力下降[2-3]。 其中人体80%~90%的葡萄糖消耗和摄取是通过骨骼肌，是葡萄糖代谢过程中最为重要的组织，目前认为游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA）的蓄积是引起骨骼肌IR 的重要原因[4]，因此选用棕榈酸（Palmitic acid，PA）诱导C2C12 肌细胞建立胰岛素抵抗细胞模型作为体外评价手段。

滇 结 香 花（Edgeworthia gardneri（Wall.） Meisn）属于瑞香科、结香属植物，俗称绿萝花，多分布在西藏、云南等地区，是西藏地区的民族特色习用药材，泡水饮用可治疗糖尿病、冠心病、高血压、高血脂等疾病[5]。 据国内外文献报道，从滇结香花中分离出的化合物主要有香豆素类、黄酮类、挥发油类、有机酸类及甾类等，具有抗菌、消炎、镇痛、降血糖及降血脂等功效[6-7]。 目前有研究表明，滇结香花水提物、有机溶剂提取物在体内、 外均具有较好的降血糖活性，因此，利用滇结香花治疗糖尿病具有良好的研究价值及应用前景。

作者所在课题组前期发现滇结香花正己烷提取物在体内、外均能有效改善IR，随后对其正己烷提取物经硅胶柱层析分离得到Fr.1。 以Fr.1 为研究对象，通过PA 诱导C2C12 肌细胞建立胰岛素抵抗细胞模型评价其体外降血糖活性， 检测IR 相关信号通路中基因、蛋白质的表达水平，探究其作用机制， 为滇结香花改善IR 从而治疗Ⅱ型糖尿病的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料滇结香花 （Edgeworthia gardneri（Wall.）Meisn）由西藏月王生物科技有限公司提供，经鉴定为瑞香科、结香属植物，标本保藏于中国科学院昆明植物研究所[8]；C2C12 成肌细胞由江南大学金坚教授实验室馈赠。

1.1.2 试剂高糖DMEM 培养基、 无酚红高糖DMEM 培养基、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、马血清（Horse serum，HS）：购自美国Gibco 公司；胰酶-EDTA 消化液、 青霉素-链霉素 （100×）、10%SDS、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）：购自碧云天公司；牛胰岛素：购自阿拉丁；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、棕榈酸（PA）、噻唑蓝（MTT）：购自美国Sigma 公司；2-（N-7-硝基-2，1，3-苯并恶二唑-4-氨基）-2-脱氧-D-葡萄糖（2-NBDG）：购自美国Invitrogen 公司；葡萄糖氧化酶法测定试剂盒：购自北京普利莱技术有限公 司；Trizol、FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）、 细 胞 裂 解 液： 购 自 美 国Roche 公 司；AMPKα、p-AMPKα、ACC、p-ACC、AKT、p-AKT 抗体： 购自Cell Signaling Technology 公司；p-IRs、IRs（Insulin receptors）、p-IRS、IRS-1 （Insulin receptor substrate-1）、Glut4、β-actin 抗 体： 均 购 自 英 国Abcam 公司；其余试剂为分析纯，购自国药集团化学有限公司。

1.1.3 仪器旋转蒸发器： 德国Heidolph 公司；Reveleris iES 中低压柱层析： 美国Grace 公司；Multiskan MK3 型荧光酶标仪： 德国Eppendorf 公司；CO2细胞培养箱： 美国Thermo 公司； 倒置显微镜：日本Nikon 公司；RT-PCR 仪、化学发光成像仪：美国Bio-Rad 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Fr.1 的制备干燥滇结香花（500 g）粉碎后，按质量体积比为1∶10 以正己烷提取， 于60 ℃浸提6 h 后过滤得澄清滤液，滤渣再重复浸提两次，合并滤液，采用旋转蒸发去除正己烷后得到滇结香花正己烷提取物15.15 g。利用中低压柱层析仪分离上述提取物，填料为硅胶，采用正己烷、乙酸乙酯为流动相进行梯度洗脱，流速30 mL/min，检测波长为254 nm 和320 nm， 在乙酸乙酯洗脱比例为14%时收集洗脱峰，经旋转蒸发得到Fr.1 5.99 g。

1.2.2 C2C12 细胞培养、 传代与分化生长培养基： 高糖DMEM 培养基+含10%胎牛血清 （FBS）+1%抗生素（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素）。

分化培养基： 高糖DMEM 培养基+含2%马血清（HS）+1%抗生素（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL链霉素）。

培养条件：置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。

细胞传代：细胞贴壁生长，至80%~90%时进行胰酶消化， 终止消化后加生长培养基悬浮细胞，接种传代。

细胞分化：细胞贴壁生长，至80%左右，换为分化培养基继续培养5~7 d，隔天换液，C2C12 成肌细胞90%分化为肌细胞即多核肌管后进行后续实验[8]。

1.2.3 MTT 法检测PA 作用C2C12 肌细胞后对细胞活力的影响将对数生长期的C2C12 细胞以5×104个/孔的密度铺于96 孔板，细胞长至80%后换为分化培养基培养5~7 d，隔天换液，待细胞分化为肌细胞后，换含2%BSA 的无酚红高糖DMEM 培养基培养12 h， 换以含不同浓度PA（0.25、0.5、0.75、1 mmol/L） 及含1 nmol/L Ins 的2%BSA 无酚红高糖DMEM 培养基培养16 h，每组6 个平行，弃去培养液， 每孔加入含0.5 mg/mL MTT 的培养基100 μL孵育4 h， 吸去培养基， 加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡使紫色结晶溶解，在570 nm 处测OD值[10]，按照公式（1）进行计算。

1.2.4 葡萄糖氧化酶法检测PA 诱导C2C12 肌细胞产生IR 对葡萄糖消耗量的影响将对数生长期的C2C12 细胞以5×104个/孔的密度铺于96 孔板，细胞长至80%后换为分化培养基培养5~7 d， 隔天换液，待细胞分化为肌细胞后，换含2%BSA 的无酚红高糖DMEM 培养基培养12 h， 换以含不同浓度PA （0.25、0.5、0.75、1 mmol/L） 及含1 nmol/L Ins 的2%BSA 无酚红高糖DMEM 培养基培养16 h[11]，每组6 个平行， 取上清培养液按照葡萄糖氧化酶法测定试剂盒检测葡萄糖含量，分为空白管、标准管、样品管， 分别对应加入5 μL 蒸馏水、5 μL 标准品（10 mmol/L）、5 μL 培养基上清液， 与195 μL 混合试剂（将R1 和R2 按照体积比4∶1 混合）于37 ℃反应20 min，在570 nm 处测OD 值，计算各组葡萄糖消耗量[12]，确定最佳造模浓度。选用最佳造模浓度分别作用细胞8、16、24、32 h，每组6 个平行，取上清培养液检测不同作用时间各组葡萄糖消耗量，与阳性对照组比较，确定最佳作用时间，按照公式（2）进行计算。

1.2.5 2-NBDG 法检测PA 诱导C2C12 肌细胞产生IR 对葡萄糖摄取量的影响将对数生长期的C2C12 细胞以5×104个/孔的密度铺于96 孔黑色荧光板，细胞长至80%后换为分化培养基培养5~7 d，隔天换液，待细胞分化为肌细胞后，换含2%BSA 的无酚红高糖DMEM 培养基培养12 h，换含有不同浓度PA（0.25、0.5、0.75、1 mmol/L）的2%BSA 的无酚红高糖DMEM 培养基培养16 h，每组6 个平行，100 nmol/L Ins 作用30 min 后， 每孔加入终浓度为50 μmol/L 的2-NBDG 孵育1 h，DPBS 漂洗细胞三遍后，换2%BSA 的无酚红高糖DMEM 培养基于激发波长485 nm、发射波长530 nm 处测定荧光值[11]，与阳性对照组比较，确定最佳作用浓度。 选用最佳造模浓度作用细胞8、16、24、32 h， 每组6 个平行，测定不同时间的葡萄糖摄取量， 确定最佳作用时间，按照公式（3）进行计算。

1.2.6 MTT 法检测Fr.1 作用C2C12 肌细胞后对细胞活力的影响将对数生长期的C2C12 细胞以5×104个/孔的密度铺于96 孔板，细胞长至80%后换为分化培养基培养5～7 d，隔天换液，待细胞分化为肌细胞后，换含2%BSA 的无酚红高糖DMEM 培养基培养12 h， 换以含不同质量浓度Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL） 及含1 nmol/L Ins、0.75 mmol/L PA 的2%BSA 无酚红高糖DMEM 培养基培养16 h， 每组6 个平行，检测方法同1.2.3。

1.2.7 葡萄糖氧化酶法检测Fr.1 改善C2C12/IR 对葡萄糖消耗的影响培养方法同1.2.6，检测方法同1.2.4。

1.2.8 2-NBDG 法检测Fr.1 改善C2C12/IR 对葡萄糖摄取的影响将对数生长期的细胞以5×104个/孔的密度铺于96 孔黑色荧光板， 细胞长至80%后换为分化培养基培养5～7 d，隔天换液，待细胞分化为肌细胞后，换含2%BSA 的无酚红高糖DMEM 培养基培养12 h， 换以含不同质量浓度Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL） 及含0.75 mmol/L PA 的2%BSA 无酚红高糖DMEM 培养基培养16 h， 每组6 个平行，100 nmol/L Ins 作用30 min 后，检测方法同1.2.5。

1.2.9 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测IR 相关基因的表达采用苯酚抽提法提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA， 采用荧光染料FastStart Universal SYBR Green Master （ROX） 进行荧光定量PCR 反应，用2-△△t法[12]对IRs、IRS-1、Glut4、PI3K、AMPKα mRNA 的表达水平进行相对定量，采用的引物见表1。

1.2.10 蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测IR相关蛋白质的表达细胞加药作用后， 预冷的DPBS 漂洗细胞， 每皿加入100 μL 蛋白质裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制剂）， 在冰上裂解30 min，将细胞刮下收集于1.5 mL 离心管中，12 000g、4 ℃离心10 min， 取蛋白质上清液，BCA 试剂盒测样品的蛋白质浓度。经10%的SDS-PAGE 电泳湿法转膜至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭后，4 ℃过夜孵育一抗，常温孵育二抗1 h，显色拍照，通过Image J 软件分析蛋白质条带， 定量检测p-IRs、p-IRS-1[10]、Glut4[13]以及AKT[14]、AMPK[13]信号通路蛋白质的表达。

表1 IR 相关基因序列Table 1 Sequences of IR primers

1.2.11 数据统计实验结果通过One-Way ANOVA 进行统计学分析，数据用平均值±标准偏差表示，p＜0.05，与阳性对照组相比，极显著水平表示为***p＜0.001，与模型组相比，极显著水平表示为###p＜0.001[11]。

2 结果与分析

2.1 棕榈酸（PA）诱导C2C12 肌细胞建立胰岛素抵抗细胞模型

组织或细胞产生IR 会降低其对胰岛素的敏感性，造成血糖代谢紊乱，所以作者采用检测葡萄糖消耗量和摄取量来反应IR 的程度。 2-NBDG 是2-脱氧葡萄糖的荧光类似物，通过识别细胞膜上的葡萄糖转运体进入细胞中，因其无放射性危害，易于检测且分辨率高，已广泛用于糖摄取及糖代谢的研究[11]。

如图1（a）所示，在无细胞毒性（0.25～1 mmol/L）的PA 作用浓度范围内， 通过检测细胞葡萄糖消耗量、葡萄糖摄取量两个指标选择建立胰岛素抵抗细胞模型的最佳作用剂量及作用时间。 如图1 （B）所示， 与阳性对照组相比， 不同浓度PA（0.25、0.5、0.75、1 mmol/L）作用于C2C12 肌细胞后，0.75 mmol/L PA 组葡萄糖消耗量有极显著的下调（***p＜0.001）；采用2-NBDG 法检测不同浓度作用下各组葡萄糖摄取量，如图1（d）所示，0.75 mmol/L PA 诱导肌细胞后葡萄糖摄取量有显著的降低（***p＜0.001）。 如图1（c、e）所示，选择最佳作用浓度0.75 mmol/L PA与C2C12 肌细胞共同孵育8、16、24、32 h，与阳性对照组相比，0.75 mmol/L PA 作用细胞16 h 后， 其葡萄糖消耗能力及摄取能力大大减弱 （***p＜0.001）；因此，选择0.75 mmol/L PA 作用C2C12 肌细胞16 h作为最佳建模条件。

2.2 Fr.1 体外降糖活性评价

2.2.1 Fr.1 对C2C12 肌细胞活力的影响将不同质量浓度的Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL）与C2C12肌细胞共孵育16 h，利用MTT 法检测细胞存活率。如图2 所示，Fr.1 在低于100 μg/mL 作用质量浓度时对C2C12 肌细胞无明显毒性， 细胞存活率均在90%以上。 Fr.1 与Ins（1 nmol/L）、PA（0.75 mmol/L）共同作用细胞16 h 后， 在100 μg/mL 的Fr.1 作用下，Fr.1 对C2C12 肌细胞的生长有12%的抑制率。因此，选择Fr.1 作用质量浓度在12.5～100 μg/mL 时与C2C12 肌细胞共孵育16 h 进行后续研究。

2.2.2 Fr.1 对C2C12/IR 葡萄糖消耗量及摄取量的影响通过检测细胞对葡萄糖的消耗量及摄取量，考察Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL）的降糖活性。 如图3 （a） 和3 （b） 所示， 与阳性对照组相比，0.75 mmol/L PA 诱导后， 细胞对葡萄糖的消耗量及摄取量显著降低（***p＜0.001），而在Fr.1 作用C2C12/IR后显著提高（###p＜0.001），且具有明显的剂量依赖关系，100 μg/mL Fr.1 与模型组相比，葡萄糖消耗量提高64.9%，葡萄糖摄取量提高60.4%。

图1 C2C12 胰岛素抵抗细胞模型的构建Fig. 1 Establishment of insulin resistance cell model in C2C12 cells

图2 不同质量浓度的Fr.1 对C2C12 肌细胞存活率的影响Fig. 2 Effects of different concentrations of Fr.1 on cell viability in C2C12 cells

2.3 Fr.1 改善C2C12 肌细胞IR 作用机制初步探讨

骨骼肌是利用葡萄糖的主要外周组织，葡萄糖进入骨骼肌细胞需要细胞膜上的Glut4 直接参与，促进Glut4 转运从而提高细胞对葡萄糖的摄取主要是通过PI3K/AKT 和蛋白激酶AMPK 两条信号转导途径来实现。 PI3K/AKT 信号传导通路的阻滞是外周组织IR 发生最基本的机制之一。胰岛素在IRs 的介导下，使IRS-1 的酪氨酸磷酸化，通过酪氨酸位点与PI3K 结合使其下游Akt 磷酸化蛋白增加，促进Glut4 转运增加其葡萄糖摄取率[15]。AMPK 信号通路在增加骨骼肌对葡萄糖的摄取、增强胰岛素敏感性、 增加脂肪酸氧化等方面发挥重要作用。 激活AMPK 是通过非胰岛素途径促进Glut4 的表达和转位，从而提高骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取，进一步改善IR[17]。乙酰辅酶A 羧化酶（ACC）被认为是AMPK活化的标志，AMPK 可以直接磷酸化ACC 的Ser79位点，从而激活AMPK 信号通路[16]。 作者通过对IR相关基因及蛋白质水平的检测，初步探讨Fr.1 改善C2C12 肌细胞IR 的作用机制。

2.3.1 Fr.1 对C2C12 肌细胞IR 相关基因表达的影响采用qRT-PCR 技术进一步检测Fr.1 对PA 诱导C2C12 肌细胞产生IR 相关基因表达水平的影响，结果见图4。0.75 mmol/L PA 诱导C2C12 肌细胞产生IR 后，IRs、IRS-1、Glut4、PI3K、AMPKα 转录水平显著降低（***p＜0.001）。 Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL） 作用C2C12/IR 后显著上调基因的表达 （###p＜0.001），且具有剂量相关性。

2.3.2 Fr.1 对C2C12 肌细胞IR 相关蛋白质表达的影响通过Western blot 法检测在0.75 mmol/L PA的诱导下， 不同质量浓度Fr.1 作用于C2C12/IR 后细 胞 中p-IRs、p-IRS-1、Glut4 及p-AMPKα、p-ACC、p-AKT 的表达。 如图5 （a） 所示，PA 作用于C2C12 肌细胞后相对于阳性对照组可显著降低p-IRs、p-IRS-1 蛋白质的表达 （***p＜0.001）， 而50、100 μg/mL 的Fr.1 作用于细胞后，IRs、IRS 磷酸化蛋白质的表达显著升高（###p＜0.001）；Glut4 是骨骼肌细胞协助葡萄糖转运的主要蛋白质，如图5（b）所示，C2C12/IR 细胞Glut4 的表达显著下降 （***p＜0.001），与阳性对照组相比下调了49.5%，50 μg/mL Fr.1 作用后使Glut4 的表达上调54.4%， 从而达到改善IR 的效果。

图3 Fr.1对C2C12/IR葡萄糖消耗及摄取的影响Fig. 3 Effect of different concentrations of Fr.1 on consumption and uptake of glucose in C2C12/IR

图4 Fr.1 组分对IRs、IRS-1、Glut4、PI3K、AMPKα 基因相对表达量的影响Fig. 4 Effect of Fr.1 on the expression of IRs、IRS-1、Glut4、PI3K and AMPKα mRNA induced by PA

PA 可以通过抑制AMPK、AKT 的信号通路从而产生IR 导致糖尿病。 如图5（c）所示，产生IR 后AMPKα 磷酸化水平明显下降（***p＜0.001），50、100 μg/mL 的Fr.1 作用于细胞后，AMPKα、ACC 磷酸化蛋白质的表达水平升高（###p＜0.001），表明Fr.1 可以激活AMPK 信号通路。 如图5（d）所示，模型组AKT（Ser473）磷酸化水平下降，给予Fr.1 处理后，明显提高了AKT （Ser473） 磷酸化蛋白质的表达水平（###p＜0.001）， 说明Fr.1 组分可以激活PI3K/AKT胰岛素信号通路。 综上所述，Fr.1 通过调控多个PA诱导的信号通路中的蛋白质表达水平改善IR。

3 结 语

张琨[18]、张晓英[19]等发现滇结香花石油醚、乙酸乙酯提取物具有良好的治疗糖尿病肾病的疗效。 钟国跃[20]、Die Gao 等[21]人发现滇结香花有机溶剂提取物通过激活PPAR 靶点作为治疗糖尿病的受体激动剂。耿燕[22]等研究表明，滇结香花提取物对酵母和大鼠来源的α-葡萄糖苷酶均具有较好的体外抑制活性。 Gao 等[23]发现滇结香花乙酸乙酯提取物通过调节AMPK 信号通路抑制脂肪细胞的分化， 从而调节脂质代谢。王赛[24]等通过建立高脂、高糖大鼠动物模型证明滇结香花具有降血糖、降血脂的功效。 综合以上研究发现，滇结香花有机溶剂提取物具有良好的降血糖活性，并且这一发现多数是利用体外抑制活性筛选模型，目前对滇结香花利用细胞模型评价药效及机制来改善IR 的研究甚少， 因此对滇结香花通过改善IR 达到治疗Ⅱ型糖尿病的研究是非常必要的。

图5 Fr.1 对C2C12/IR 细胞p-IRs、p-IRS-1、Glut4、p-AMPKα、p-ACC、p-AKT 蛋白质表达的影响Fig. 5 Effect of Fr.1 on expression of p-IRs、p-IRS-1、Glut4、p-AMPKα、p-ACC、p-AKT in C2C12/IR

作者通过PA 诱导C2C12 肌细胞建立胰岛素抵抗细胞模型，运用此模型研究了滇结香花正己烷提取物Fr.1 的体外降糖活性。 结果表明，Fr.1 可促进C2C12/IR 对葡萄糖的消耗和提高对葡萄糖的摄取。 通过对IR 相关基因及蛋白质表达的检测，发现Fr.1 可显著增加胰岛素与IRs 结合来磷酸化IRS-1的酪氨酸位点，从而激活PI3K，PI3K 又激活蛋白激酶AKT，最终激活葡萄糖转运体Glut4。 Fr.1 亦可上调p-AMPKα 及p-ACC 蛋白质的表达， 从而促进Glut4 的转位。Fr.1 通过激活PI3K/AKT 和AMPK 两条信号通路增强了细胞周围的葡萄糖转运水平，起到改善IR 的效果。

后期需要对滇结香花提取物Fr.1 进一步分离纯化，分析鉴定Fr.1 中主要活性物质，同时结合体内、体外模型， 进一步研究其治疗Ⅱ型糖尿病的作用机制，为民族特色习用药材治疗糖尿病提供理论依据。