酵母菌高糖胁迫机制的研究进展

雷梦琳 ，李湘銮，白卫东*，赵文红，刘功良，郭 波，黄文彪

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510225；2.广东石湾酒厂集团有限公司，广东佛山 528031；3.佛山市海天（高明）调味食品有限公司，广东佛山 528511）

耐高糖酵母是一种在高糖环境中能生长、发酵产生乙醇和二氧化碳的真菌，其转化能力强，发酵效率高，能适应高渗的恶劣环境[1-3]。在高糖胁迫下，细胞内也会产生过量的活性氧和活性氮等，这些有害物质的产生使一氧化氮合酶被激活，进而生成过氧亚硝基，过氧亚硝基会破坏机体，使细胞损伤[4]。随着发酵的进行，常能发现胞内物质的组成会发生改变，水分活度的改变会使细胞膜破裂，也抑制了细胞内相关酶的活性，这对酵母发酵有不利影响，不仅使酵母生长延缓，还会降低其发酵效率和发酵产量。这是由于酵母在发酵初期处于一个高糖的环境，在高糖环境下发酵会不断产生乙醇，压力不断增大，导致对细胞的毒害作用增强[5-6]，使酵母获得高糖耐受力，对减少高糖环境中对酵母生长的不利因素、降低对细胞的毒害作用和提高酵母发酵效率具有重要意义。

本文对耐高糖酵母进行代谢组学、转录组学、蛋白质组学和基因组学研究，更深刻了解耐高糖酵母的胁迫机制，对定向改造酵母菌的性能和酿酒工业具有重要意义。

1 耐高糖酵母的筛选

1.1 自然筛选

菌种在自然环境条件下，不需要人为手段改造而通过长时间的变异、进化，从而改变自身性能来适应不断变化的环境，得到人们想要具有某种性能的菌株就是自然筛选。自然筛选的一般步骤是先寻找初始菌株，再对初始菌株进行培养，富集到一定程度后分离菌种，最后鉴定是否具有研究所需的某种性能[7]。

杜鹃等[8-9]从东北椴树蜜发现一株耐高糖酵母，富集后进行分离得到酵母菌YMI-37，对其进行生理形态分析、基因组测序等发现酵母菌YMI-37为酵母菌属的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。该酵母能适应80%高糖浓度的环境，测得其初始发酵速度快，发酵效率高。LIU G L等[10]在17个陈旧蜂蜜样品中，富集培养后分离纯化得到了6株蜂蜜接合酵母，均属于耐高糖酵母菌。邱巨香等[11]经过对中蜂蜜和意蜂蜜的分离、纯化、菌种鉴定，结果显示，中蜂蜜和意蜂蜜中的耐高糖酵母都是鲁氏接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）。吴启凤等[12]从贵州水晶葡萄中分离纯化后得到性能较优的菌株SJJM-7和SJJM-18，对这两株菌株的性能进行研究，发现在50%的高糖模拟葡萄汁培养基中检出菌株SJJM-7和SJJM-18，说明这两株菌株均具有耐高糖性能。目前，自然筛选的耐高糖酵母菌株大多数来自高浓度糖环境如蜂蜜、果汁、甘蔗、高糖果酒等，能在高糖环境下存活的酵母一般具有耐高糖性能。

1.2 诱变育种

诱变育种是一种现代育种技术，它利用物理、化学因素对动植物进行处理，诱导其遗传特性发生突变，再从发生突变的样品中选择符合人们意愿的菌株，对其进行进一步富集培养获得新品种或种质的育种方法。诱变育种的一般步骤：自然筛选→富集培养菌种分离→菌种纯化→人工诱变→逐级筛选→性能鉴定[13]。根据诱变的方式，可分成紫外线诱变和自然驯化。

1.2.1 紫外线诱变

紫外线诱变法是一种被大多数人认可的诱变育种方法，该方法对酵母菌先进行分离筛选后再诱变，其操作方便，容易使酵母菌发生正突变。陈英[14]对野生酿酒酵母菌株MF02进行紫外诱变，将发生突变的菌株涂布到YP40培养基中，将1株来自30 s诱变时间突变体库的菌株和1株来自45 s诱变时间突变体库的菌株一同放在50 mL的YP40培养基中发酵，测其生长曲线和酒精含量，发现来自30 s突变体库的突变菌株UV02_HG性能较优，其在40%葡萄糖压力下仍能快速生长、高速发酵。徐日益等[15]以酿酒酵母AS2.1189为初始菌株，对其进行紫外诱变，诱变到100代后得到两株菌株B2和A17，均能适应高渗环境。潘慧丽等[16]以蜂蜜、葡萄、面包3种原料进行酵母菌富集菌株，通过梯度驯化与紫外诱变相结合的手段选育耐高糖且发酵特性优良的酵母菌株，最终获得具有耐高糖性能的酵母菌株FM-1.1-40，其最大耐受糖度为40%。

1.2.2 自然驯化

自然驯化是可操作性强，方向性明确的筛选方法。熊雅兰等[17]通过对野生型甘蔗糖蜜发酵高产乙醇菌株MF1002的呼吸突变菌株MF15C进行驯化，发现菌株MF15C比MF1002更加适应高糖环境。黄星源等[18]对青梅酒酵母S05进行耐高糖驯化中，在总糖为200～300 g/L青梅清汁中都能在9～19 h较快启动发酵，发酵第15天时，酒精度可以达到16.8%vol，残糖含量为3.5 g/L。

1.3 基因工程育种

诱变育种的筛选工作量大，突变具有不稳定性和多样性，效率较低。随着基因技术的发展，基因工程育种渐渐成为常见的筛选方法，该方法可操作性强，目的明确。基因工程育种是将目的基因导入受体细胞，对菌种进行改造获得人们意愿的性能。

沈玉平[19]通过在god基因前端插入α-淀粉酶信号肽序列，α-淀粉酶信号能在胞外分泌，插入目的基因后酶能够高效分泌到胞外，酶活性发生改变，从而得到能在高糖环境，高温条件下发酵的菌株。张晓阳等[20]通过代谢工程与全基因组重组得到了抗逆高产乙醇的酿酒酵母。王立光等[21]利用同源重组法得到了NHX1基因缺失突变株，对NHX1基因的逆境胁迫性能进行研究，发现NHX1基因是重要的离子反向转运体，缺失NHX1基因会使酿酒酵母BJ3505的抗逆性降低。

2 高糖胁迫应激代谢特性

随着酿酒技术的进步和酿酒工业的发展，国内外对耐高糖酵母的代谢途径和代谢产物已有较多研究成果，大多数认为细胞通过主动调节甘油、海藻糖等物质的分泌量来应对高糖环境。由于其代谢途径的复杂性和代谢产物的多样性，目前国内外对于耐高糖酵母具体的代谢特性和应答机制还有待进一步研究。

蜂蜜接合酵母6-7431对营养物质的代谢能力较强，刘功良等[22]研究其在高糖胁迫下的应激代谢产物，发现在高糖环境下酿酒酵母甘油的分泌量会增加，在不超过700 g/L糖质量浓度的环境中可以调节渗透压，可能是在高糖胁迫下由于在此范围内合成甘油的基因和海藻糖合成基因的表达量增加所致[23]。海藻糖是耐高糖酵母发酵过程中的一种生物相容性溶质，细胞通过主动调节海藻糖分泌量来适应高糖环境，保护其免受高糖胁迫环境对细胞的细胞膜、蛋白质、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）等大分子物质的破坏[24-25]。甘油是耐高糖酵母发酵过程中的一种典型的应激代谢产物，甘油内的羟基使其具有良好的亲水性，能有效调节细胞渗透压，保护细胞免受因渗透压的改变而导致细胞的破坏[26-27]。三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）代谢中间产物对酵母在高糖环境下应激反应具有重要的影响，糖酵解和磷酸戊糖途径中相关酶蛋白增加[28]，导致乙酰辅酶A更多地进入到TCA中。在高糖环境中，酿酒酵母在发酵过程中由于TCA中断，有氧呼吸受到抑制，不断积累的α-酮戊二酸和苹果酸等TCA中间产物会降低发酵效率[29]。

时桂芹等[30]以酿酒酵母为模型，对不同葡萄糖浓度的四组酿酒酵母细胞（20 g/L葡萄糖组、40 g/L葡萄糖组、60 g/L葡萄糖组和80 g/L葡萄糖组）培养4～8 h，随着环境胁迫的进行，海藻糖积累量先升高后下降，海藻糖积累量最高点出现在8 h。在不同葡萄糖浓度胁迫下，酵母细胞胞内外甘油的积累随着时间增加呈现出先上升后下降的趋势，但是胞内甘油的积累量在80 g/L葡萄糖质量浓度时达到最高，而胞外甘油的积累量在60 g/L葡萄糖质量浓度时达到最高。这些结果进一步验证了在高糖胁迫下甘油和海藻糖是酿酒酵母的主要相容性溶质。当酿酒酵母在葡萄糖含量达到80 g/L的高糖环境时，酵母生长缓慢，细胞出现高糖胁迫，此时细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性均显著增高（P＜0.05），说明细胞通过调节这些抗氧化物酶的活性来维持细胞正常的渗透压。耐高糖酵母代谢过程中与不同酶的活性有着密不可分的联系，酶类是细胞内氧化反应的重要物质，将代谢应激物和酶类联系在一起，在TCA、糖酵解和磷酸戊糖途径等代谢途径中检测酶活力和代谢产物的种类、含量和代谢特性，建立清晰的代谢网络以便更深刻地认识酵母耐高糖应激机制。

3 酵母菌耐受高糖机制的转录组学和蛋白质组学研究

酵母菌耐受高糖机制与胞内转录因子的表达和蛋白质的合成有着复杂的调控关系，目前转录组学和蛋白质组学在酵母耐受高糖机制上的应用越来越热门，主要是通过对不同生长阶段耐高糖酵母菌转录组的测序和蛋白质合成来研究与其有关的转录因子和蛋白质，从而综合分析进一步了解具体的酵母耐受机制。陈英[14]对40%葡萄糖压力下菌株MF02和UV02_HG的表达差异基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集，发现在高糖压力下两菌株间的表达差异主要集中在核糖体、氧化磷酸化、内质网蛋白加工过程、硫胺素代谢、吞噬体和胞吞作用、蛋白输出、糖代谢途径和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径。

3.1 从转录水平研究酵母耐受高糖机制

吴静等[31]研究发现，光滑球拟酵母（Candida glabrata）的基因CgASG1缺失会降低对氧化胁迫和高渗胁迫的抵御能力。此前研究了缺失CgASG1基因对光滑球拟酵母转录组水平的影响，C.glabrata中的转录因子Asg1p能维持生物鲁棒性，但其不参与细胞利用非发酵性碳源这个过程，缺失基因CgASG1光滑球拟酵母对高酸的耐受力较弱。这是因为在高酸环境下ATPase活性相关基因的转录发生了改变，细胞胞内质子数量增加，酸性增强导致胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量升高[32]，进一步影响了胞内的代谢系统[33]，氧化还原相关基因转录水平的变化影响胞内氧化还原电势，进而改变细胞生长[34]。叶美玲[35]对南极酵母AN5不用铜离子处理和铜离子处理的两组酵母菌进行转录组的测序，整理分析测序数据后，找出相关差异基因，对其进行功能分析。检测南极酵母AN5在重金属胁迫下基因表达上调或下调是否明显，并从差异基因中找到可能起明显作用的三个基因，再设置实验进一步验证。结果表明在铜离子胁迫下，基因GST和WD重复蛋白的表达量有所上调，推测这两个基因可能与酵母菌耐受机制有关。

3.2 从蛋白质水平研究酵母耐受高糖机制

陈英[14]对突变菌株的耐高糖性研究发现内质网蛋白加工过程途径上的分子伴侣基因SSA1（+2.4）、SSA3（+3.7）、SSA4（+2.3）、SSB2（+1.8）、SCJ1（+2.4）、HSP42（+2.3）、CNE1（+1.8）和PDI1（+2.0）全部表达上调。在细胞质和内质网中的热激蛋白负责蛋白折叠和分泌，作为分子伴侣参与细胞多种压力的应激[36]。钙网蛋白（CNE1）在内质网内膜上，作为分子伴侣参与糖蛋白合成和蛋白折叠[37-38]。可见突变菌株的耐高糖性状和蛋白质加工中的分子伴侣有着密切联系。

田一雄等[39]采用二维电泳技术对脉冲电场处理前后哈密瓜汁中酿酒酵母蛋白质进行检测分析，发现酿酒酵母中硫氧还蛋白过氧化物酶表达上调，细胞的自我防御需要该酶的调节，说明脉冲电场（pulsed electric field，PEF）处理过程中酿酒酵母细胞启动代谢调控来应对环境的变化。延长因子2也发生了表达上调，该因子在蛋白质合成过程中起到重要作用，说明经PEF处理，酿酒酵母细胞为适应环境的变化，细胞需要更多的蛋白质。

4 酵母菌耐受高糖机制的基因组学研究

耐高糖酵母的基因耐受机制近年来备受学者关注，随着基因技术的发展，关于酵母基因耐高糖机制可以通过DNA提取，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，比对基因库等对其进行基因测序，找出与其相关的基因，通过敲除这些基因，与未敲除的对照组进行对比，研究其在高糖环境下的发酵性能，检测基因表达水平等来进一步验证耐高糖酵母的作用基团。

4.1 GPD2、SUC2和HXT1基因表达水平对高糖胁迫下槲皮素处理酵母的影响

徐晓丹等[40]以酿酒酵母S288c为模型，分析高糖胁迫下槲皮素对其胞内损伤的保护作用及机制。在高糖胁迫处理后，酿酒酵母S288c中GPD2基因表达量相对对照组下降了45.30%，SUC2基因表达量相对对照组下降了51.30%，而HXT1基因相对表达量比对照增加了7.54倍，GUT1基因相对表达量与对照组相比基本持平。可见高糖胁迫下用槲皮素处理，GPD2和SUC2基因的表达会受到抑制，HXT1基因表达上调，所以GPD2、SUC2和HXT1基因的表达水平上调能提高酿酒酵母S288c的发酵效率。

4.2 敲除STE12、TUP1基因后对突变菌株UV02_HG的影响

陈英[14]对突变菌株UV02_HG中敲除STE12基因后，敲除菌株的细胞膜通透性降低，但其较菌株UV02_HG更能适应高糖环境。基因回补表达后菌株细胞膜对蛋白质的透性有所增强，由此判断STE12基因可能与细胞膜对蛋白质的通透性有关，从而进一步调控自身适应高糖环境。而基因TUP1缺失后，菌株UV02_HGΔTUP1与菌株UV02_HG相比，在酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基中生长缓慢，相对呼吸强度较弱，基因回补表达的菌株UV02_HGΔTUP1在YPD培养基中的生长和相对呼吸强度都有所恢复。推测TUP1基因参与调控细胞呼吸相关的基因来维持酵母细胞的正常生长，菌株UV02_HGΔTUP1对高糖的耐受能力増强，由此推断TUP1基因缺失后，细胞的呼吸作用削弱，通过对糖类物质的利用改变细胞膜透性，从而使细胞具有高糖耐受性。

4.3 GPD2基因和tdcD基因对酵母的影响

工业酿酒酵母中GPD2基因与甘油合成途径密切相关，黄广庆[41]用工业酿酒酵母AS2.489为起始菌株，敲除GPD2基因，再通过单倍体融合来得到二倍体的GPD2基因缺失菌。用20 g/L的葡萄糖进行摇瓶发酵实验，发现敲除GPD2基因后的缺失菌株与起始菌株相比，甘油含量和乙酸含量都有一定程度的下降，乙醇含量有所提高。推测GPD2基因与合成甘油途径相关，合成甘油途径的受阻会进一步影响发酵速率和发酵周期。孟刚等[42]为控制乙酸溢流，在乙酸代谢途径中敲除了丙酸激酶编码基因tdcD，该基因具有乙酸激酶活性。通过设置“微糖”和“高糖”两个发酵环境的两个实验组，检测在不同糖浓度条件下乙酸含量的变化和对酵母菌的影响。发现敲除了tdcD基因的酵母菌在高糖环境下，在对数生长后期依然发酵旺盛，产酸效率高，色氨酸产量较对照组高，而产乙酸量较对照组低，推测tdcD基因与酵母菌高糖耐受机制有一定相关性。

5 结论与展望

随着分子生物学与基因工程的迅速发展[43]，越来越多学者从代谢组学、基因组学、转录组学和蛋白质组学来研究酵母菌高糖耐受机制。代谢组学上，可以检测耐高糖菌株的代谢应激产物和与代谢途径相关的酶类，了解其代谢途径和生理特性，建立清晰的代谢网络。基因组学上，可以对表型差异大的菌株进行高糖胁迫处理，跟踪胁迫前后相关基因的表达，深入研究其表达特性，找到耐受机制的关键基因，对定向改造酵母菌具有重大意义。转录组学上，可以通过对相关基因的敲除菌株和回补菌株进行研究，找到转录因子对耐受机制的影响。蛋白质组学上，可以通过对重要酶类进行研究，进一步揭示耐高糖酵母的蛋白合成。