放疗与肿瘤微环境的相关进展

苏琳琳 周欢娣 薛晓英

(河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000)

手术、放疗、化疗是癌症的三大主要治疗手段。世界卫生组织(WHO)统计数据显示，三者对癌症治疗的贡献率分别为27%、22%、和6%，其中放疗的作用与手术相当。另据WHO统计，肿瘤患者中近70%患者需要放射治疗。放疗会影响肿瘤发生特异性免疫，包括显著增加 CD8+T细胞启动〔1〕、增强肿瘤特异性抗原释放〔2〕、诱导免疫原性细胞死亡(ICD)〔3〕、促使主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ和新抗原表达〔4〕、促进Ⅰ型干扰素(IFN)〔5〕和补体生成〔6〕、提高活化性受体凝集素样同型二聚体(NK2GD)配体表达〔7〕。放疗诱导的ICD会导致胞外钙网蛋白过表达，并释放损害相关性分子模型(DAMPs)高机动性组盒(HMGB)1和三磷酸腺苷(ATP)。这些分子可募集并激活抗原提呈细胞，进而启动与肿瘤特异性抗原相关的T细胞反应〔8，9〕。由此可见，放疗与肿瘤免疫微环境的关系十分密切。其中，放疗过程中出现的远隔效应就是这一复杂关系的产物之一。而外泌体作为肿瘤免疫微环境成员之一，对肿瘤的生物学行为及辐射诱导的旁效应影响重大。本文对放疗与肿瘤微环境的相关进展进行综述。

1 放疗与外泌体

1.1外泌体概况 细胞可分泌各种酶类、激素、神经递质、局部介质、血清蛋白、抗体、细胞外基质等成分。此外，还可释放一些囊泡类物质，细胞释放到胞外微环境的囊泡主要有三种类型：外泌体、细胞微泡和凋亡小体〔10〕。外泌体是一种膜性结构的囊泡，直径最小为50～150 nm，来自胞内早期形成的多囊体，可由正常细胞和肿瘤细胞释放，内含微小RNA、信使RNA、蛋白质和脂质等成分〔11〕。外泌体的生物进程包含四个主要步骤：起始膜形成、胞吞、多囊体形成、分泌至胞外或被溶酶体溶解。因其参与细胞之间的通信交流〔12〕、免疫反应〔13〕和凋亡逃逸〔14〕，近些年最受关注。

1.2放疗对外泌体形成分泌及构成的影响 外泌体的前体是细胞膜形成的早期多囊体，释放到细胞外通过吞噬或膜融合的方式由受体细胞摄取，进而激活细胞内某一特殊过程。电离辐射对外泌体释放最显著的两个影响因素为：辐射诱导的DNA损伤及p53相关通路的激活。放疗不仅会直接导致DNA的损伤，还可激活许多相关通路，p53就是其中之一。受环境应力影响的p53蛋白可调节许多基因的转录，一些受此蛋白调节的分泌蛋白会参与相邻细胞的信息交流。Yu等〔15〕应用蛋白质组学的方法探测受照射的细胞培养基中依赖p53通路分泌的蛋白含量，发现培养基中除了已知的p53基因转录的蛋白，许多非p53基因转录的基因编码蛋白在激活p53后也有所增加，这些蛋白由外泌体携带至胞外。并发现一种由p53调节的基因产物——血清总酸性磷酸酶可提高微环境中外泌体的形成分泌，进而与临近细胞甚至免疫系统细胞进行信息交流。

外泌体不仅是内含细胞残骸的质膜性胞外囊泡，还包含某些特殊的分子。ExoCarta 2012数据库系统总结了不同来源外泌体的分子构成情况，包括外泌体的蛋白质、脂质和RNA〔16〕。外泌体的构成主要取决于分泌细胞的类型，也受分泌细胞暴露条件的影响，其中最主要的暴露因素是电离辐射。有研究认为电离辐射对外泌体构成的影响取决于细胞模型和电离辐射模式的不同：Arscott等〔17〕用4 Gy的电离辐射(IR)照射24～48 h多形性成胶质细胞瘤细胞U87MG，结缔组织生长因子mRNA及 胰岛素样生长因子结合蛋白2抗体蛋白表达水平显著提高；Lehmann等〔18〕用4 Gy的IR照射前列腺癌细胞(22Rv1)96 h，检测到B7-H3蛋白含量显著增多；Hurwitz等〔19〕证明经放疗的病人血清中热休克蛋白72含量增多；Jelonek等〔20〕则用以2 Gy的剂量照射人头颈部鳞癌细胞(FaDu)18 h后，参与翻译转录的蛋白真核起始因子(EIFs)，叶酸水解酶(PSMs)，核糖体蛋白(RPLs)和核蛋白体蛋白(RPSs)、与细胞周期或细胞分裂有关的蛋白(分子伴侣、泛素化相关蛋白和蛋白酶)及细胞信号蛋白核糖基化作用因子(ARFs)，Rab蛋白(RABs)及Ras蛋白(RASs)含量增多，而载脂蛋白类和免疫球蛋白类表达水平则降低。尽管上述研究的对象和结果不同，但一致认为外泌体运载的物质确实反映了电离辐射导致的细胞特定变化。

1.3外泌体的功能及对放疗的影响 正常细胞的外泌体参与启动免疫调节活动。外泌体携带的MHC-肽复合物与同源T细胞受体结合激活致敏性CD4+/CD8+T淋巴细胞〔21，22〕，进而协助启动机体的免疫反应，保护机体免受肿瘤等异物伤害。外泌体激活免疫反应的能力与其携带的膜抗原有关〔23〕，免疫效应则取决于细胞的生理状态〔24〕。

肿瘤细胞分泌的外泌体也可能携带免疫抑制肽复合体，通过某些机制抑制机体免疫反应。有研究证明外泌体能够减慢自然杀伤细胞〔25〕或CD4+/CD8+T细胞〔26〕的增殖、促进骨髓细胞〔27〕和调节T细胞〔28〕的变异，从而抑制或干扰机体的免疫反应，帮助肿瘤逃脱免疫监视，促进肿瘤生长。来自肿瘤细胞的外泌体还与肿瘤的扩散和转移有关。研究表明〔17〕，照射引起的外泌体特定变化在一定程度上通过加强神经生长因子(NGF)-酪氨酸蛋白激酶(Trk)A及黏着斑激酶(FAK)信号通路的激活促进脑胶质瘤细胞的迁徙和转移。

近来有研究强调环境应力对外泌体调节细胞间信息交流影响重大，并证明电离辐射可通过不同的信号转导系统显著影响细胞之间的信息交流。外泌体通过向周围或远处靶细胞传递与细胞凋亡、生存、分裂、生长、变异有关的或多重或独特的信号调节细胞之间的信息交流〔29〕，进而影响肿瘤生物学行为及治疗效果。与辐射相关的细胞间信息交流对放疗影响最明显的是辐射诱导的旁效应，是指通过细胞接触或细胞间通讯将直接受照射细胞的应答传递给周围未受辐射的细胞，后者也表现出与受照射细胞类似的生物学效应〔30～35〕。外泌体在RIBE中发挥着关键作用：Al-Mayah等〔36，37〕先后证明受照MCF7 细胞的旁效应，与辐射引起的基因不稳定性和外泌体的含量及其携带的RNA、蛋白质息息相关。

此外，受照细胞对外泌体的摄取也受影响。有研究〔38〕表明，暴露于电离辐射的人骨髓源性细胞会通过CD29/CD81络合物的生成和依赖p38丝裂原活化蛋白激酶的胞吞和胞饮增加对外泌体的摄取。

2 远隔效应

Mole〔39〕最初描述道，放疗的远隔效应是指照射原发肿瘤，照射路径外的远处转移瘤体也有反应的现象。肿瘤免疫反应的抑制支持了免疫系统对远隔效应有影响的假设。我们认为远隔效应是由系统抗肿瘤免疫反应引起的，但这种现象在临床实践中很罕见〔40〕。系统免疫反应的缺失是由肿瘤微环境中局部免疫抑制造成的。免疫效应细胞包括骨髓衍生抑制细胞(MDSC)、FoxP3+T调节细胞(Tregs)、抑制性细胞因子(如：转化生长因子-β、白细胞介素-10)和一些“免疫检查点”分子，这些会引起局部T细胞抑制〔41〕及树突细胞的亚最佳启动。

2.1远隔效应的临床证据 放疗本身的远隔效应临床罕见且目前只有案例报告。继1953年Mole之后，Ehlers、Rees、Ohba、Wersäll、Postow、Golden等又先后在乳头状腺癌〔42，43〕、肝细胞癌骨转移〔44〕、肾细胞癌脑转移〔45〕、黑色素瘤〔46〕、转移性非小细胞肺癌〔47〕的放疗过程观察并报道了这种效应。最近，Reynders等〔40〕总结了1973～2013年间23例在单独放疗中出现远隔效应的案例，中位年龄为64.5(28～83)岁，肾细胞癌是最常见的组织类型，原发肿瘤和转移肿瘤分别占35%、65%，中位剂量为32(12.00～60.75)Gy，1.2～26.0 Gy/f。出现远隔效应的平均时间是开始放疗后5个月(1～24个月)，随访结束或疾病进展前13个月。

2.2远隔效应的基础研究 远隔效应确实是由免疫系统介导的。Demaria等〔48〕应用小鼠乳腺癌67NR模型证实了这个观点，并证明这种效应具有癌种特异性。其在试验中观察到放疗联合生长因子Flt3配体(Flt3-L可增加树突细胞的数量)可在同一小鼠另一相同癌种的瘤体中观察到远隔效应，而同一小鼠不同癌种的瘤体、单独应用Flt3-L或在T细胞缺陷模型中均无此现象；而后又利用小鼠免疫缺陷型转移性乳腺癌4T1模型〔49〕证实局部放疗原位乳腺癌和抑制细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA)-4联合应用可提高对肺转移癌的控制。Dewan等〔50〕在TSA小鼠乳腺癌模型和MCA38小鼠结肠癌模型中同样证实分割放疗联合应用CTLA-4抗体才可诱发远隔效应。

长期以来，我们一直认为局部放疗的作用机制为射线对肿瘤细胞的直接杀伤作用，即导致肿瘤细胞DNA损伤。近来有学者证明，放疗的“场域”效应也依赖于免疫系统。包括促进肿瘤抗原扩增、改变和表达，激活免疫应答，诱导T细胞应答，调节肿瘤间质细胞等。 Lee等〔1〕应用小鼠模型研究证明放疗会显著增强淋巴组织中T细胞启动导致原位肿瘤和远处转移瘤体通过依赖CD8+T细胞的形式缩小甚至消失，并进一步证明这种由放疗启动的免疫反应和瘤体缩小效果会随着长期传统分割放疗或辅助化疗减弱，却会因局部免疫治疗增强。有研究还证明局部高剂量放疗可引发Ⅰ型IFN的产生，进而启动先天性和获得性免疫反应攻击肿瘤〔51〕，但若树突细胞中缺乏IFN-α/β 受体1则不能将免疫原性的肿瘤细胞抗原呈现给CD8+T细胞〔52〕。

2.3如何增强放疗的远隔效应 免疫治疗正在开辟新前景以增强远隔效应。上文已叙述放疗与CTLA-4抗体、放疗与Flt3-L联合应用在小鼠模型中均可促进远隔效应的出现。研究表明：当前大部分免疫治疗通过抑制CTLA-4、程序性死亡受体(PD)-1、TIM3等免疫抑制因子及抑制间质细胞(如 MDSC)来调节肿瘤微环境，促进 T细胞活化和应答〔53〕。因此，PD-1、TIM3、MDSC有可能成为新的免疫位点与放疗联合应用。

在临床工作中，Postow等〔46〕首次报告了1例黑色素瘤转移患者放疗期间出现的远隔效应，但在伊匹单抗(一种可以抑制T细胞免疫检查点的单克隆抗体，CTLA-4) 维持治疗期间疾病发生进展。此外，Postow等〔46〕还证明肿瘤缩小和免疫抗体反应具有时间相关性，并发现外周血免疫细胞(骨髓生成抑制细胞和激活的CD8+CD4+T细胞)也有变化〔46〕。此后，又有研究先后〔46，54～57〕报告了黑色素瘤患者在伊匹单抗治疗时存在远隔效应。总结得知，首次注射伊匹单抗和开始放疗的时间间隔为1.5～18个月，出现远隔效应的时间是放疗开始后1～6个月。Stamell等〔55〕还观察到在远隔效应出现期间抗黑色素瘤抗体增加，MAGEA3也伴随增多，并出现针对癌症抗原PASD1的新反应。

3 放疗如何发展以提高治疗效果

电离辐射不但能够诱发免疫原性癌症细胞死亡，还作为一种危险因子发放免疫信号排斥肿瘤〔58〕。电离辐射可触发肿瘤免疫排斥机制，首先将肿瘤转化为独特的原位疫苗并激发获得性免疫反应，通过外泌体及其介导的旁效应和远隔效应影响原位肿瘤及远处转移瘤体。但在许多情况下，仅靠电离辐射不能抵制肿瘤特异性免疫抑制。尽管已观察到辐射会诱发远隔效应并调节机体对肿瘤的免疫反应，但这种反应在临床实践中很少见。虽然放疗本身足以提供细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)对肿瘤抗原交叉启动的必要信号，但这种辅助作用似乎相对较弱。放疗会激活新的抗肿瘤CTLs，但对尚未治疗的远处转移肿瘤，CTLs通常无法克服肿瘤微环境的免疫抑制作用。

但以上一系列研究已证实无论是放疗使瘤体缩小的直接作用机制，还是由外泌体介导的旁效应，亦或远隔效应均与肿瘤免疫微环境密切相关甚至可通过联合免疫治疗强化放疗疗效。这给我们一个重大启示：将系统免疫疗法与放疗相结合来提高肿瘤的治疗效果。而免疫位点、放疗模式与两者结合的时机目前尚无定论，有待进一步研究。