干扰或过表达PDIA3 对过氧化氢诱导的星形胶质细胞损伤的影响

雷雨广 徐继鹏 陈超 张伟丽

(1信阳市第二人民医院病理科，河南 信阳 464000；信阳职业技术学院 2护理学院；3附属医院皮肤科)

星形胶质细胞属于脑组织中的一种胶质细胞，通过分泌激素、营养因子参与神经元生长及凋亡等生物学过程，可调控中枢神经系统等疾病的发生及发展过程〔1〕。研究显示，脑组织中氧化应激反应常可导致脑组织损伤〔2〕。因而探究星形胶质细胞氧化应激损伤机制对减少细胞凋亡具有重要意义。兔脊髓缺血再灌注损伤模型蛋白质二硫键异构酶(PDI)A3呈高表达，与脊髓缺血再灌注损伤密切相关〔3〕。PDIA3可作为一种保护蛋白调控神经退行性病变过程，还可通过减少氧化和内质网应激降低缺血诱导的损伤〔4,5〕。然而，相关研究显示，甲型流感病毒可引发内质网氧化应激反应并上调PDIA3表达，下调PDIA3表达可通过抑制凋亡蛋白表达进而抑制上皮细胞凋亡〔6〕。目前关于PDIA3表达变化对星形胶质细胞损伤的影响尚未见报道，本研究通过双向调控PDIA3表达探讨PDIA3表达变化对过氧化氢(H2O2)诱导的星形胶质细胞损伤的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂 胎牛血清、RPMI1640培养基均购自美国GIBCO公司；二甲基亚砜(DMSO)购自上海生物工程有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自上海艾研生物科技有限公司；RNA提取及实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)实验所需试剂均购自日本TaKaRa公司；噻唑蓝(MTT)检测试剂盒购自上海齐一生物科技有限公司；PDIA3 siRNA(si-PDIA3)、阴性对照(si-NC)及pcDNA过表达载体均购自美国Invitrogen公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；白细胞介素(IL)-6检测试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司；乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠PDIA3与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗均购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗人磷酸化(p)-p38与p38抗体均购自美国CST公司。

1.2星形胶质细胞培养 参照李清等〔7〕研究报道培养星形胶质细胞，麻醉出生2～3 d无特定病原体(SPF)级雄性小鼠，取出T11～L6处脊髓背角组织，加入胰蛋白酶消化，放入温度37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养，30 min后取出细胞悬液接种于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基的培养瓶内，8 d后置于摇床震荡15 h，以5×106个/ml细胞接种于24孔细胞板(包被多聚赖氨酸)中进行传代培养，继续培养3～7 d后待星形胶质细胞纯度达98%左右时收集细胞进行后续研究。

1.3构建PDIA3干扰及过表达载体稳定株系 收集星形胶质细胞，胰蛋白酶消化后接种于6孔板(5×103个细胞/ml)，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱培养，待细胞生长融合至80%更换为不含胎牛血清的RPMI1640培养基，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书分别将si-con、si-PDIA3、pcDNA 及pcDNA-PDIA3转染入星形胶质细胞，转染6 h后更换含有10%胎牛血清新鲜的RPMI1640培养基，继续培养48 h。采用qRT-PCR与Western印迹检测验证转染效率，构建转染稳定株系。

1.4H2O2诱导星形胶质细胞损伤模型及分组 选取对数生长期星形胶质细胞，分为对照组(NC组)与H2O2组，其中NC组不进行任何处理；H2O2组中在星形胶质细胞中加入100 μmol/L H2O2制备氧化损伤模型〔8〕。收集转染后12 h星形胶质细胞，加入浓度为100 μmol/L的H2O2作用24 h，实验将星形胶质细胞分为NC组、H2O2组、H2O2+si-con组、H2O2+si-PDIA3组、H2O2+pcDNA组、H2O2+pcDNA-PDIA3组，继续培养12 h后进行检测。

1.5qRT-PCR检测PDIA3 mRNA表达 利用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，参照反转录试剂盒合成cDNA，严格按照qRT-PCR检测试剂盒配置反应体系，反应条件为95℃ 10 min循环1次，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环40次。PDIA3 以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算PDIA3 mRNA相对表达量。

1.6Western印迹检测PDIA3及p38MAPK信号通路蛋白表达 收集“1.2.3”中各组星形胶质细胞，加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液提取总蛋白，利用二喹啉甲酸(BCA)法检测样品浓度，取50 μg蛋白样品分别与上样缓冲液混合，经10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)反应(80 V 30 min，120 V 2 h)，将蛋白凝胶转移至硝酸纤维素膜，2 h后用脱脂奶粉封闭60 min，加入稀释比为1∶1 000的PDIA3、p38及p-p38蛋白一抗，再把膜放入IgG二抗(1∶5 000)中反应，室温放置2 h，TBST清洗3次，10 min/次，采用电化学发光(ECL)进行显影反应，置于凝胶成像系统分析，利用Quantity One软件分析蛋白条带积分光密度值，蛋白相对表达量为目的蛋白条带积分光密度值与GAPDH内参条带积分光密度值的比值。

1.7检测星形胶质细胞活力 分别取各组星形胶质细胞，以细胞密度为5×104/L接种于96孔细胞培养板(120 μl/孔)，放入37℃、体积分数5%CO2培养箱培养，培养48 h后分别加入浓度为5 g/L的MTT溶液(20 μl)，4 h后弃培养基，分别加入DMSO 150 μl，置于摇床内10 min，放入酶标仪检测各孔在波长为490 nm处光密度值，细胞存活率(%)=(实验组细胞光密度值/正常组细胞光密度值)×100%。培养48 h后收集上清液，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测LDH含量，LDH释放率(%)=细胞培养基内酶活力单位/(细胞裂解液测定酶活力单位+细胞培养基内酶活力单位)×100%〔9〕。

1.8检测上清液中TNF-α、IL-6浓度 采用放射免疫法检测各组细胞培养基上清液中TNF-α、IL-6水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.9流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组星形胶质细胞接种于6孔细胞板，胰酶消化制备细胞悬液，置于离心机，1 000 r/min离心15 min，分别加入1 ml结合缓冲液悬浮细胞(5×104/L)，按照试剂盒说明书分别加入5 μl Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)与5 μl碘化丙啶(PI)，室温避光孵育20 min，置于流式细胞仪检测并计算细胞凋亡率。

1.10统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 实 验

2.1H2O2对星形胶质细胞PDIA3表达的影响 H2O2组星形胶质细胞中PDIA3 mRNA和蛋白相对表达量显著高于NC组(P<0.05)，见图1、表1。

2.2PDIA3干扰或过表达载体构建 与si-con组相比，si-PDIA组PDIA3 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与pcDNA组比较，pcDNA-PDIA3组PDIA3 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图2，表2。表明PDIA3干扰或过表达载体构建成功，可用于后续实验。

图1 两组星形胶质细胞PDIA3蛋白表达

表1 两组星形胶质细胞PDIA3 mRNA和蛋白表达

与NC组比较:1)P<0.05

1～4: si-con组，si-PDIA3组，pcDNA组，pcDNA-PDIA3组图2 4组星形胶质细胞PDIA3蛋白表达

表2 4组星形胶质细胞PDIA3 mRNA和蛋白表达

与si-con组比较:1)P<0.05；与pcDNA组比较:2)P<0.05

2.3PDIA3干扰或过表达对H2O2诱导的星形胶质细胞损伤的影响 H2O2组星形胶质细胞培养液中LDH释放量显著高于NC组(P<0.05)，星形胶质细胞存活率显著低于NC组(P<0.05)，表明H2O2可加重星形胶质细胞损伤，减少星形胶质细胞存活。与H2O2+si-con组比较，H2O2+si-PDIA3组LDH释放量明显增加，星形胶质细胞存活率明显降低(P<0.05)。与H2O2+pcDNA组比较，H2O2+pcDNA-PDIA3组LDH释放量明显减少，星形胶质细胞存活率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。表明PDIA3过表达可有效减少星形胶质细胞LDH释放量并提高细胞存活率，抑制PDIA3表达作用效果则相反。

2.4PDIA3干扰或过表达对H2O2诱导的星形胶质细胞炎症因子分泌的影响 与NC组相比，H2O2组星形胶质细胞TNF-α、IL-6水平均明显上升(P<0.05)，表明H2O2可促进星形胶质细胞发生炎症反应。与H2O2+si-con组相比，H2O2+si-PDIA3组星形胶质细胞中TNF-α、IL-6水平均显著升高(P<0.05)；与H2O2+pcDNA组相比，H2O2+pcDNA-PDIA3组TNF-α、IL-6水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。表明PDIA3可能通过抑制H2O2诱导的星形胶质细胞炎症反应进而发挥保护作用。

2.5PDIA3干扰或过表达对H2O2诱导的星形胶质细胞凋亡的影响 H2O2组星形胶质细胞凋亡率显著高于NC组(P<0.05)。H2O2+si-PDIA3组星形胶质细胞凋亡率显著高于H2O2+si-con组(P<0.05)；H2O2+pcDNA-PDIA3组星形胶质细胞凋亡率显著低于H2O2+pcDNA组(P<0.05)，见表3、图3。表明PDIA3过表达可抑制H2O2诱导的星形胶质细胞凋亡。

2.6PDIA3干扰或过表达对星形胶质细胞p38MAPK信号通路的影响 H2O2组星形胶质细胞中p-p38蛋白表达明显高于NC组(P<0.05)，表明H2O2可能激活p38MAPK信号通路。H2O2+si-PDIA3组星形胶质细胞中p-p38蛋白表达明显高于H2O2+si-con组，差异有统计学意义(P<0.05)。H2O2+pcDNA-PDIA3组星形胶质细胞中p-p38蛋白表达显著低于H2O2+pcDNA组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组星形胶质细胞中p38表达水平相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表3、图4。表明PDIA3过表达可能通过抑制p38MAPK信号通路活化进而发挥作用。

表3 各组LDH释放量、细胞存活率、IFN-α、IL-6、p-38、p-p38及细胞凋亡率比较

与NC组比较：1)P<0.05；与H2O2+si-con组比较:2)P<0.05；与H2O2+pcDNA组比较：3)P<0.05

图3 各组星形胶质细胞凋亡率

1～6：NC组，H2O2组，H2O2+si-con组，H2O2+si-PDIA3组，H2O2+pcDNA组，H2O2+pcDNA组-PDIA3组图4 各组星形胶质细胞中p38和p-p38蛋白表达

3 讨 论

星形胶质细胞可通过促进血脑屏障形成并调控代谢过程以保护中枢神经系统，并可通过修复及保护神经细胞调控神经元发育〔10〕。机体内氧化应激反应导致脑组织氧化状态失衡而造成脑组织氧化损伤〔11〕。

PDIA3可促进蛋白质折叠并可参与乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤发生及发展过程〔12〕。β-淀粉肽与PDIA3结合形成复合物从而保护神经系统，若PDIA3与β-淀粉肽的结合能力减弱导致神经退行性病变〔13〕。研究表明PDIA3可通过调控脂肪代谢过程进而参与非酒精性脂肪肝发生及发展过程，同时PDIA3还可通过影响体内炎症反应调控肠易激综合征发生过程〔14,15〕。H2O2属于体内代谢产生的活性氧并可诱导神经细胞损伤而建立细胞氧化损伤模型〔16〕。本研究说明PDIA3可参与星形胶质细胞氧化应激损伤过程。机体内氧化应激发生时细胞膜脂质过氧化可促使细胞膜结构变化异常从而增加细胞膜通透性，细胞内LDH流出细胞至细胞膜外，检测细胞培养液中LDH释放量增加表示细胞氧化损伤〔17〕。本研究提示上调PDIA3表达可能通过抑制H2O2诱导的星形胶质氧化应激损伤而抑制细胞凋亡，增强细胞存活能力。

机体处于氧化应激状态时p38MAPK信号通路被激活，p38MAPK可从细胞质进入细胞核并通过促进TNF-α等炎症因子释放而促进疾病进展，抑制星形胶质细胞分泌TNF-α、IL-6等促炎性细胞因子可降低其氧化应激反应〔18,19〕。张瑶等〔20〕研究表明，利拉鲁肽可通过抑制p38MAPK信号通路激活进而改善高同型半胱氨酸诱导的大鼠海马组织炎症及氧化应激损伤〔20〕。汪莲等〔21〕研究表明抑制p38MAPK信号通路激活可通过降低Caspase-1、IL-1β等表达而降低炎症反应。本研究说明PDIA3过表达能够抑制H2O2诱导的星形胶质细胞炎症反应。同时本研究说明PDIA3过表达可抑制p38MAPK信号通路激活。提示PDIA3可能通过抑制p38MAPK信号通路活化而降低TNF-α、IL-6等促炎性细胞因子水平而抑制星形胶质细胞炎症反应。

综上，PDIA3可通过抑制p38MAPK信号通路活化而发挥抗炎性反应、抗氧化应激作用，为防治星形胶质细胞氧化应激损伤提供理论依据。