FTO基因敲低对动脉粥样硬化斑块内Th细胞的影响

王舟 祁春梅

(徐州矿务集团总医院心内科，江苏 徐州 221000)

根据各项统计资料的结果，不论是按各大主要城市还是按全国分类，心血管病死亡率都居于第一〔1〕。其中动脉粥样硬化(AS)斑块的形成是心血管疾病发病的主要病理基础。AS斑块形成的因素机制主要包括：①炎症-免疫反应；②氧化-应激反应；③细胞凋亡-自噬；④血管正性重构；⑤新生血管和淋巴管；⑥斑块应力和剪切力等。其中，核心机制是炎症免疫反应，贯穿整个AS斑块形成的始终。细胞的免疫作为炎症免疫反应的主要部分，其机制复杂，Th在免疫应答中充当了中间介质作用。通过自我增生扩散，间接激活其他类型免疫细胞，使其直接作用于炎症反应〔2〕。生物体内，甲基化过程涉及重金属修饰、基因表达调控、蛋白质功能调节及核糖核酸(RNA)加工。大量研究表明m6A在各种基本生物过程中具有重要的功能，m6A修饰的T细胞特异性递送可能是缓解各种自身免疫疾病的有效治疗途径〔3〕。其中FTO基因起到去m6A RNA甲基化作用。Li等〔4〕首次阐明了m6A修饰在T细胞介导的相关发病机制中的体内生物学作用。证实了m6A mRNA甲基化通过靶向白细胞介素(IL)-7/信号传导及转录激活蛋白(STAT)5/细胞因子信号抑制物(SOCS)途径控制T细胞稳态，进而抑制肠炎的发生〔4〕。最新研究表明FTO在衰竭的哺乳动物心脏和缺氧的心肌细胞中表达减少，从而增加了RNA中的m6A表达，降低了心肌细胞的收缩功能〔5〕。本研究通过敲低AS兔的FTO基因， 观察其病理变化及辅助性T细胞(Th)的变化。

1 材料和方法

1.1动物 3月龄健康纯种雌性新西兰大白兔，于徐州医科大学实验动物中心购买，实验设计经徐州医学院实验动物伦理委员会批准，许可证号：SYXK(苏)2015-0029，合格证编号201904540。

1.2病毒 FTO腺相关病毒(AAV9-FTO)由苏州吉玛基因公司提供。病毒位点的shRNA靶点信息：FTO-兔-146 GCAGCTGAAATATCCTAAACT、FTO-兔-236 GCACAAGATGGCTGCTTATT、FTO-兔-524 GCCAGTGCATGGCAGAATT；CD3+,CD4+抗体由BIO-RAD公司提供。

1.3AS模型的建立 兔先称重，然后放在固定的兔栏中经耳缘静脉注射 1%戊巴比妥钠(10 mg/ml)麻醉。麻醉成功后，固定在动物手术台上。选取右侧股动脉(搏动最强点)上方为手术部位，先行剃毛、消毒，然后解剖，逐层分离皮下组织和肌肉，钝性分离出股动脉约3 cm。股动脉远端使用止血夹夹闭，使用7号针头穿刺出小口，放入引导针。松开止血夹，观察引导针中动脉出血明显，送入 0.014英寸(0.036 cm)导丝，抽出引导针，然后沿导丝将直径3.5 mm、长15 mm的球囊导管(用 1∶15 稀释的肝素钠生理盐水浸润)送入腹主动脉约 20 cm，推注蒸馏水达8个大气压以充盈球囊，然后回拉球囊至髂总动脉，反复回拉 3 次以确保造成腹主动脉内皮损伤，退出球囊导管后压迫局部伤口止血，股动脉两端扎上细线标记(未结扎)，局部和肌肉给予青霉素预防感染。A 组为假手术组, B组于股AS处理射病毒空载体(GFP),C 组为 FTO敲低组。 均行高脂喂养9 w。

1.4病毒的注入 9 w末所有兔1%戊巴比妥钠经耳缘静脉完全麻醉，C组动脉斑块上将滴度为 8×109pfu/ml 的AAV9 (FTO敲低)病毒注入，上下两端暂时阻断该处血流10 min后恢复血供完成后关闭腹腔，局部及肌肉给予青霉素预防感染。

1.5苏木素-伊红(HE)染色 染色步骤:脱蜡，覆水，苏木染色，伊红染色，脱水，透明，中性树胶封固。10 w 末3组各取兔3只提取组织总蛋白。取组织，研磨,加入放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液。 置于超声波细胞裂解仪内裂解 10 min。 将裂解好的组织置于低温高速离心机内,4°C,12 000 r/min,离心15 min,离心后取上清,置于-80°C冰箱内保存备用。 测定蛋白凝胶电泳： 装板，配胶，上样，裁胶，铺膜，封闭，孵育，显色。结果以图像软件 image plus pro 分析处理。

1.6兔动脉斑块中淋巴细胞的提取 空气法处死兔,取标记部位动脉, 置于灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)；取组织块称重后,用眼科剪刀无菌操作,将组织剪成小块； 将组织块放在 70 μm细胞筛网上, 用研磨器反复研磨,加入匀浆冲洗液,使细胞全部通过筛网滴到离心管中；弃去筛网,组织研磨液经900 r/min,离心 10 min,弃上清； 用样本稀释液重悬组织细胞, 备用； 取一支离心管,加入与组织单细胞悬液等量的分离液。 用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上,800～1 000 r/min,离心20～30 min；离心后,第二层为环状乳白色淋巴细胞层；用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15 ml 离心管中,向离心管中加入 10 ml 洗涤液,混匀细胞； 500 r/min,离心 10 min。弃上清。用吸管以 5 ml 清洗液重悬所得细胞。500 r/min,离心 10 min。 弃上清后以0.5 ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。

1.7细胞流式检测 细胞表面分子标记:细胞大约1×106,经 PBS 洗涤 2 次,每个反应加入 100 μl(含1 μg的抗兔的CD3、CD4 抗体) 反应液,室温反应1 h,PBS 洗涤2次,避光加入反应液,室温反应30 min,PBS 洗涤2次,即可上机检测。

1.8统计学方法 采用SPSS19.0软件进行χ2检验及Wilcoxon符号秩检验。

2 结 果

2.1实验动物的一般情况及模型建立 整个实验过程中30只新西兰大白兔共死亡4只，A组1只死于感染，1只死于麻醉；B组1只死于麻醉；C组1只死于感染，最终存活26只。根据兔子的血管粗细、体重差异，在压力的选择上，除了单纯地根据之前的经验外，还应根据拉动球囊时的阻力适当调整压力大小，一般在8～10个大气压之间。通过血管彩超可以明显判别斑块的生成。见图1。

图1 兔AS模型及斑块生成前后

2.2病理学结果 10 w末处死兔并取粥样斑块组织行HE染色图片，C组斑块炎症反应更为明显。A组、B组明显可见大量泡沫细胞，血管壁变薄，内皮剥落，管腔明显变窄。C组可见斑块内出血，内皮剥脱伴表面血小板聚集。见图2。

2.3Western印迹结果 A组与B组FTO蛋白表达(0.991±0.053 vs 0.979±0.310)无统计学差异(P>0.05)。A组与C组FTO蛋白表达(0.261±0.082)有统计学差异(P<0.01)。B组与C组有统计学差异(P<0.001)。见图3。

2.4细胞流式结果 各组斑块淋巴细胞、CD3+CD4+T细胞数量见表1。A组与B组CD3+CD4+T细胞比例(43.6% vs 46.8%)差异无统计学意义；A组与C组(53.0%)差异有统计学意义(P<0.01)；B组与C组差异有统计学意义(P<0.001)。见图4。

图2 各组10 w末斑块组织(HE)

图3 各组FTO蛋白Western印迹

表1 各组斑块淋巴细胞数量(n=3，个/ml)

图4 各组CD3+CD4+T细胞流式结果

3 讨 论

FTO 作为第一RNA脱甲基酶〔6〕，其发现及探索恢复了RNA甲基化研究，表明m6A是一种可逆的动态RNA修饰，存在影响生物调节的可能，类似于可逆DNA和组蛋白修饰〔7〕。2012年，m6A RNA免疫沉淀的全转录组方法被报道，紧接着出现了下一代测序(m6A-seq或MeRIP-seq)，并在人类和小鼠细胞的7 000多个mRNA转录本和数百个长非编码RNA中检测到m6A峰，其中许多m6A峰在人类和小鼠之间存在相似性〔8〕。因此，这些研究表明mRNAs中m6A甲基化是一种普遍的修饰，可能具有功能重要性。最近的研究表明，mRNA或非编码RNA中m6A的修饰在组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克反应控制和昼夜节律控制及RNA命运和功能，如mRNA稳定性、剪接、转运、定位和翻译、初级microRNA加工和RNA-蛋白质相互作用中发挥关键作用〔9〕。FTO和ALKBH5(2013年鉴定的第二种RNA去甲基化酶)都属于AlkB家族，并以Fe(Ⅱ)-和α-酮戊二酸依赖的方式催化m6A脱甲基，被称为m6A“擦除物”。甲基转移酶样蛋白(METTL)3和METTL14被鉴定为m6A“写入者”，它们在WTAP的支持下形成异二聚体以催化m6A甲基化。YTHDF1/2/3被鉴定为m6A“读取器”，其优先结合G〔G>A〕 m6ACU共有序列中含有m6A的RNA，并导致不同的生物学后果，如诱导RNA衰变和促进mRNA翻译。已知FTO与人体体重增加和肥胖密切相关〔10〕。动物模型研究表明，FTO缺乏可以防止肥胖并导致生长迟缓〔11〕，而FTO的过度表达导致食物摄入增加和肥胖。在人类中，FTO的功能丧失突变也导致严重的生长迟缓。作为第一个被鉴定的RNA去甲基化酶，FTO调节靶mRNA的去甲基化，FTO调节大脑中多巴胺能信号并且还调节成脂调节因子的mRNA剪接，因此在成脂过程中起关键作用。

2016年，何川教授在Nature Reviews Genetics上发表关于m6A RNA综述，全面解析了m6A的作用机制〔12〕。作为真核生物mRNA上最常见的转录后修饰，超过80%的RNA碱基甲基化与其相关。其研究发现，m6A加速了细胞mRNA代谢和翻译的修饰；在细胞分化、胚胎发育和免疫应答等过程中起重要生理作用。综上可以推断敲低FTO基因可以升高组织m6A mRNA水平进而影响T细胞稳态。本研究反向验证了甲基化对T细胞稳态的作用。

AS斑块形成的特点包括：①局部受损后，炎症细胞浸润，T细胞转化为淋巴巨噬细胞，通过各种反应生成泡沫细胞，反复炎症反应，最后形成各种的斑块组织。②斑块组织在各种其他因素的影响下，不断发生演化。其中细胞免疫机制是其核心。本次研究的重点在T淋巴细胞，按T细胞表面分子T细胞受体(TCR)分类，可分为αβ+T细胞、γδ+T细胞两类。在体内αβ+T细胞分布广，抗原识别受体种类繁多。αβ+T细胞之后可进一步分为CD4+T细胞及CD8+T细胞。CD4+T细胞识别外源性抗原肽〔主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子所提呈〕，活化后主要分化为Th(CD3+CD4+)。Th在免疫应答中充当了中间介质作用。通过自我增生扩散，间接激活其他类型免疫细胞，使其直接作用于炎症反应〔13〕。

本次研究结果提示，表面FTO基因对Th的调控具有意义。基于以上事实：①FTO 调控m6A 甲基化水平。②FTO基因敲低，AS稳定性降低。③FTO基因敲低CD3+CD4+T细胞(Th)占T细胞的比例明显升高。可以推断FTO基因敲低在调控m6A 甲基化水平同时，降低了T细胞的稳态。

以往治疗AS更多的是从病因学的角度考虑，控制危险因素。免疫因素作为危险因子之一，可控制的方法并不多，假设能够通过调节相关因子的水平，起到控制局部炎症反应，稳定AS。

本课题组在之前的研究中，已经成功建立了兔AS模型，其基础就是在动脉内皮球囊拉伤的基础上，高脂喂养。本次研究选择了之前实验成功的AS兔模型。此模型兔中暂无METTL3和METTL14敲低型，选择注射AVV-FTO敲低来达到局部甲基化；按照理论，整体注射AVV9-FTO效果更加明显，但基于经费和兔的体重，这个操作不切实际，选择局部注射AVV9-FTO敲低达到甲基化的效果。

FTO基因如何调节m6A对于人体不同细胞的作用是复杂的，2018年科研成果使用了临床人类心衰样本、猪和小鼠心力衰竭模型及原代心肌细胞进行研究，探索在心脏稳态重构及修复过程中脂肪含量和FTO依赖的m6A转录的生理和病理学作用，研究表明FTO在衰竭的哺乳动物心脏和缺氧的心肌细胞中表达减少，从而增加了RNA中m6A表达，降低了心肌细胞的收缩功能〔5〕。现在研究的焦点主要集中在甲基化过程对于不同组织器官的影响，特别是在肿瘤及血液疾病中，如①肿瘤干细胞生长，自我更新和肿瘤发生〔14〕。②核糖核酸代谢，包括核糖核酸/微小核糖核酸/低核糖核酸生物发生、加工和出口〔13〕。③FTO/m6A/MYC/增强癌结合蛋白质α信号通路〔15〕。④IL-7/STAT5/SOCS途径〔4〕。本次研究着重在AS斑块形成中FTO基因对Th细胞的影响，对于m6A甲基化通路研究仍待发掘。