女性儿童和青少年肿瘤患者生育力保存研究进展

周怡，郭映纯，方丛

（中山大学附属第六医院生殖医学研究中心，广州 510655）

全球儿童和青少年肿瘤的发病率从1975年至2011年上升了42%，而死亡率下降了57%［1］。随着肿瘤治疗技术的进步，儿童和青少年肿瘤患者的远期生存率不断提高，白血病患儿5年生存率达到88%，其它肿瘤可达92%［2］。生育力受损是抗肿瘤治疗常见的远期并发症之一，在儿童和青少年期接受过放化疗治疗的患者成年后发生卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）和不孕的风险增加，一部分患者因此而无法生育。这对于成年的肿瘤存活者及家庭来说，常会带来巨大的精神心理压力，严重降低生活质量［3］。

美国临床肿瘤学会（ASCO）指南建议，每位儿童和青少年患者在抗肿瘤治疗前都应进行生育力保存咨询。通过手术、药物和辅助生殖技术保护患者的生育力，使其在成年后能生育遗传学后代，已成为提高儿童和青少年肿瘤患者成年后生活质量的重要措施［4］。女性生育力保存的方法主要有胚胎冷冻、卵子冷冻和卵巢组织冷冻（ovarian tissue cryopreservation，OTC），目前公认的首选方案为胚胎／卵子冷冻［5］。对于儿童和青少年肿瘤患者而言，因未婚和部分患者生殖系统尚未发育，在制定生育力保存方案时需要综合考虑生理和社会伦理多方面因素。本文将针对女性儿童和青少年肿瘤患者，阐述抗肿瘤治疗对生育力的影响、生育力保存措施及研究进展。

一、抗肿瘤治疗对生育力的影响

在儿童或青少年期接受过放化疗的女性，成年后POF的发生风险是其同胞姐妹的10倍，怀孕和获得活产的机率也减少［6］。抗肿瘤治疗的生殖毒性与患者年龄、化疗药物种类、药物剂量、放疗部位、放疗剂量等多种因素相关［7－8］。

1．化疗：烷化剂是常用化疗药物中对性腺毒性最大的一类，包括有环磷酰胺、白消安、甲基苄肼、氮芥等，通过与DNA发生交叉联结，破坏DNA结构产生细胞毒性。烷化剂属于细胞周期非特异性药物，对生长中和静止期的卵泡均有毒性作用，大剂量的烷化剂（总环磷酰胺≥4 000mg／m2）导致女性发生不孕的概率超过80%［9］。Levine等［6］对2 930名儿童肿瘤幸存者生育力进行分析，发现在儿童期甲基苄肼暴露剂量≥4 000mg／m2的成年幸存者发生POF的风险是同胞姐妹的8．96倍，而且随着烷化剂累计剂量的增加，成年后怀孕的机率下降［7］。紫杉醇、顺铂和蒽环类药物（阿霉素、柔红霉素）等药物为中等性腺毒性，抗代谢药物（甲氨蝶呤、阿糖胞苷、5－氟尿嘧啶）和长春碱类对性腺毒性极低［10］。

2．放疗：卵母细胞对辐射损伤敏感，任何剂量的卵巢辐射都会增加POF的风险，且其发生率呈剂量依赖性。追踪儿童期肿瘤的成年幸存者，发现当卵巢暴露的辐射剂量＜500cGy时，POF发生风险是正常同胞姐妹的3倍，当辐射剂量≥500cGy时，发生风险增加至8倍［6］。大剂量（≥10Gy）的卵巢照射以及全身照射（total body irradiation，TBI）会导致急性卵巢衰竭，头颅部的放疗会损害下丘脑－垂体－卵巢性腺轴。卵巢或子宫曾暴露于5～10Gy的辐射，成年后妊娠的几率减少至56%，如果＞10Gy则急剧减少至18%［7］。患者年龄越小，卵巢对放疗的耐受性越高，导致不孕的盆腔或全腹部放疗剂量在出生时、10岁、20岁、30岁女性中分别为20．3Gy、18．4Gy、16．5Gy和14．3Gy［11］。放疗还会损害子宫的内膜、肌层和血管，增加自然流产、胎儿生长受限、妊娠期高血压疾病、早产的发生风险［10］。

3．儿童和青少年常见肿瘤治疗后风险：抗肿瘤治疗方案常联合使用多种化疗药物，有些还需同时进行放／化疗，因此不同患者的不同治疗方案，导致不孕的风险也不同。急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤是儿童最常见的肿瘤，急性淋巴细胞白血病化疗方案的性腺毒性低，淋巴瘤不同治疗方案的性腺毒性不同。霍奇金淋巴瘤治疗中含有烷化剂的方案，如MVPP（氮芥，长春碱，甲基苄肼，泼尼松龙），COPP（环磷酰胺，长春新碱，甲基苄肼，泼尼松龙）和ChlVPP（苯丁酸氮芥，长春碱，甲基苄肼，泼尼松龙）方案对卵巢毒性大，治疗后停经的发生率为38%～57%，而ABVD方案（阿霉素，博来霉素，长春碱，氮烯唑胺）的性腺毒性明显降低［9］。非霍奇金淋巴瘤治疗后不孕的发生风险可达44%［9］。中枢神经系统肿瘤也是儿童和青少年常见肿瘤，头颅放疗为常用治疗方案，35～45Gy的放疗剂量会导致性腺功能减退。对于需要骨髓移植的患者，TBI或大剂量化疗最终导致不孕的风险大于80%［4］。Wallace等［11］根据儿童和青少年常见肿瘤和治疗方案，对不同肿瘤治疗后不孕不育的发生风险进行了等级划分（表1）。

表1 儿童和青少年肿瘤治疗后不孕不育的发生风险［11］

二、生育力保存方法

对青春期后患者，卵子冷冻是目前公认的标准方案，而青春期前患者的主要方法是OTC。在临床实践中要根据每个患者的年龄、病情和个人意愿，综合衡量利弊后做出最优选择。

1．卵子冷冻：对于青春期后的肿瘤患者，卵子冷冻是保存生育力的首选方法［12］。随着卵子冷冻技术日趋成熟，2013年美国生殖医学学会（ASRM）提出成熟卵子冷冻技术应作为一项成熟技术应用于临床工作［13］。现在每个冷冻卵子的临床妊娠率为4%～12%，最终形成的每个移植胚胎妊娠率为36%～61%，与新鲜卵子和冷冻胚胎相比无统计学差异［14］。

卵子冷冻最好在放化疗开始之前进行，从控制性卵巢刺激（COS）开始到取卵冷冻至少需要2～3周，所以只适用于抗肿瘤治疗可以推迟的患者。在COS过程中体内雌激素处于超生理水平，这对雌激素敏感肿瘤（如乳腺癌）患者是否安全一直是临床医生的顾虑。对这部分患者可选择联合使用来曲唑或他莫昔芬的COS方案，在降低体内雌激素水平的同时不影响胚胎质量和妊娠率，对乳腺癌患者随访发现，也不会增加肿瘤复发的风险和降低生存率［15－16］。

青春期前和不能耐受COS的患者，可从卵巢中穿刺抽取未成熟卵，经过体外培养成熟（IVM）后冷冻保存。Abir等［17］从42名2～18岁要进行OTC的肿瘤患者的卵巢中穿刺抽取未成熟卵，同时过滤进行卵巢切片的液体，最终28例成功保存冻卵，年龄最小的是一名5岁白血病患儿。通过这种方法获得冷冻卵子的数目与年龄呈正相关，年龄越大获得冻卵数目越多。

2．OTC：对于青春期前患者，OTC是保存生育力的主要方法。OTC不需要2～3周的卵巢刺激，也适用于肿瘤治疗无法推迟和不能耐受COS的患者［18］。OTC要通过手术切取部分卵巢组织或者单侧卵巢，然后切割卵巢组织皮片冷冻保存。重新移植回去的卵巢组织能维持生殖内分泌功能4到5年，最长可达7年，患者可以通过自然怀孕或辅助生殖技术获得妊娠。自2000年世界第1例冷冻卵巢组织成功移植至今，已有超过130名婴儿诞生［19］。根据最近的数据统计，卵巢组织冷冻移植后的活产率可达到37．7%［20］。虽然目前报道的活产基本都来源于成年女性的冷冻卵巢组织，但对一些尚未进入青春期患者再移植儿童和青少年期冷冻的卵巢组织后，可以引发第二性征发育及月经来潮［18］。Demeestere等［21］报道了1位在14岁行OTC的镰形红细胞贫血患者，10年后移植回卵巢组织，最终自然怀孕诞下一名健康男婴，这说明了OTC在儿童和青少年患者中的可行性。

3．促性腺激素释放激素激动剂（GnRH－a）卵巢抑制：GnRH－a与GnRH受体有高度亲和力，持续使用或使用长效制剂，能下调垂体表面受体，内源性促性腺激素分泌被抑制，从而达到药物性垂体－卵巢抑制。处于静止期的细胞对化疗药物敏感性降低，如果卵巢被抑制，理论上可以降低化疗药物的毒性作用。Blumenfeld等［22］回顾性对比分析了在化疗中使用和未使用GnRH－a的肿瘤患者化疗结束2年后的卵巢功能和妊娠情况，两组POF的发生率分别为13%和51%，自发妊娠率分别为65．6%和37．9%，差异有统计学意义。对早期乳腺癌化疗患者应用GnRH－a卵巢抑制有利于化疗后恢复正常月经和减少早发性卵巢功能不全的发生风险［23－24］。但一项前瞻性临床随机对照试验示，淋巴瘤化疗患者使用GnRH－a不能保护卵巢功能和提高妊娠率［25］。Chen等［26］对多个随机对照试验分析认为，GnRH－a在化疗中可以保护卵巢功能，但对于生育力的保护尚缺乏足够证据。目前关于GnRH－a对生育力保护的效果存在较多争议，ASCO最新指南指出，不推荐其作为肿瘤患者保护生育力的有效方法，只有当其它方法都不可行时再考虑使用［20］。

4．卵巢移位：卵巢移位是指通过手术将卵巢暂时移至放疗区域之外，可以一定程度保护盆腔放疗患者卵巢免遭损害，待放疗结束后适当时机可选择将卵巢移回盆腔或进行体外受精。根据不同的研究结果，卵巢移位对保存生育力的成功率为50%～95%不等，与放疗剂量、放疗面积和次数、是否联合化疗以及患者年龄相关［4］。该方法只适用于盆腔放疗的患者，而且手术有导致肿瘤转移的风险，所以最好在放疗要开始前进行手术，并充分告知患者风险［12］。

对于携带有肿瘤易感基因的肿瘤患者，可通过植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）选择不携带相关易感基因的胚胎。PGD已被应用于数十种遗传性癌症易感疾病，包括早发性高外显率疾病如李－佛美尼综合症、家族性腺瘤样息肉病等，和低外显率迟发性疾病，如与BRCA1／2相关的遗传性乳腺癌卵巢癌综合征（HBOC）［27］。欧洲人类生殖及胚胎学会（ESHRE）和英国人类受精和胚胎学管理局（HFEA）认为PGD可应用于HBOC一类迟发性疾病［28］。但因遗传性易感癌症的外显率、发病年龄和现有预防治疗措施各不相同，是否应该执行PGD目前尚存在诸多争议。对这部分肿瘤患儿进行生育力保存时，应同时接受遗传咨询，充分告知患者病情、PGD技术的利弊以及后代的患病风险。

三、挑战与展望

卵巢组织再移植有肿瘤细胞再种植的风险，尤其是在血液肿瘤患者中［29］。对于只能选择OTC的患者，如何更好地保存生育力是现在面临的主要问题。学者们提出将卵巢组织中窦前卵泡分离出来，在体外培养至成熟进行体外受精，也可用从冷冻卵巢组织中分离出来的窦前卵泡和生物材料构建人工卵巢。这样既可避免肿瘤再种植风险，又保存利用了卵巢中大量未成熟卵泡［14］。结合3D培养的卵泡多阶段体外培养体系已经成功建立在多个物种中，小鼠中已可以从原始卵泡体外培养至活产［30］，灵长类动物可以次级卵泡培养至桑葚胚阶段［31］，在人类有报道从原始或次级卵泡培养至成熟卵泡［32－33］。

人工卵巢指是用生物材料构建一个可以供卵泡生长的基质环境，将窦前卵泡放置在其中，再移植回体内继续生长［34］。从人冻融卵巢组织中分离出来的卵泡包裹于纤维蛋白支架中，移植到裸鼠体内7d后约有20%存活［35］。近期有报道通过3D打印技术与小鼠卵泡构建的人工生物卵巢，移植到绝育小鼠体内后，不但发挥了内分泌功能，而且有3只受体小鼠自然怀孕并产生后代［36］。人工卵巢技术在小鼠中取得重大成果，但在大型哺乳动物和人中尚处于初步研究阶段。除此之外Hikabe等［37］利用小鼠的多能干细胞，在体外成功诱导了卵子的发生和发育成熟过程，并最终有活产产生，这将是未来保存生育力的一个重要研究方向。

四、结语

随着儿童和青少年肿瘤患者生存时间延长，保存生育力是保障成年后生活质量的重要措施，也受到越来越多人的关注。每位肿瘤患者在治疗前都应进行生育力保存的相关咨询，但因为信息缺乏、医疗资源不足、肿瘤带来的压力和经济伦理等问题，目前在治疗前接受生育力保存咨询的患者只有一小部分，最终进行有效生育力保存的人更是少数。卵子冷冻是进入青春期后、抗肿瘤治疗可以推迟2～3周和可以耐受COS的患者保存生育力的标准方案。而青春期前和抗肿瘤治疗不能推迟的患者，OTC是主要方法。应用GnRH－a卵巢抑制和卵巢移位对生育力的保存效果存在很大的不确定性，不推荐作为有效方法，当不得不选用这两种方法时应充分告知患者存在的风险。窦前卵泡分离体外培养和人工卵巢技术是未来保存生育力的发展方向，有很广阔的应用前景，如何提高原始卵泡的成熟率、建立高效完整的培养体系、构建人工卵巢等问题都还需要解决。除此之外，还应提高临床医生和患者及家属关注生育力保存的意识，优化诊疗体系，这对儿童和青少年肿瘤患者生育力的保存也至关重要。