二氢卟吩p6醚类光敏剂的合成及光动力抗癌活性研究

马福家，孟 志，张星杰，王 媛，马志强，姚建忠,（. 海军军医大学海军特色医学中心药剂科，上海0005；. 海军军医大学药学院，上海 004；. 宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004）

光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）是一种基于光化学的肿瘤治疗新技术。PDT通过定向光照摄入光敏剂的肿瘤组织，由光、肿瘤组织中的氧和光敏剂三者联合作用产生单线态氧、超氧阴离子和自由基等活性氧物质（reactive oxygen species，ROS），其中，ROS通过启动3种抗肿瘤生物机制而发挥抗肿瘤效应[1-3]：①ROS直接杀伤肿瘤细胞；②肿瘤相关性血管闭合，导致肿瘤组织发生大面积缺血性坏死；③激活机体内的抗肿瘤免疫记忆和系统免疫反应。

卟啉、二氢卟吩和菌绿素等四吡咯类化合物是目前研究最多的一类光敏剂。第一代卟啉类光敏剂卟吩姆钠（porfimer sodium）和喜泊芬等最早获批用于临床肿瘤PDT，并取得了显著疗效，但存在成分复杂结构不明确、最大吸收波长短（～630 nm）且摩尔吸收系数小使630 nm激光对病灶组织的穿透性差、体内代谢慢导致滞留光敏副作用持续时间长等缺陷。相比卟啉类光敏剂，二氢卟吩及菌绿素类化合物具有化学结构明确、最大吸收波长长（＞650 nm）且吸收系数高一个数量级（该波长激光对组织穿透更深）、单线态氧产率高（光敏作用更强）、体内清除快（滞留光毒性小）等优点，已成为新一代光敏剂的研究热点[4-8]。其中，他拉泊芬（talaporfin）、维替泊芬（verteporfin）、替莫泊芬（temoporfin）和帕利泊芬（padeliporfin）已先后获批上市[9-10]。

紫红素-18（4）为二氢卟吩类叶绿素a稳定降解产物，具有显著的PDT抗癌活性[11]，但其内酸酐环化学性质活泼、成药性差，而其内酸酐水解物二氢卟吩p6（3）又极不稳定，室温放置即很快脱水变回4。课题组前期研究表明，二氢卟吩f的3-乙烯基成醚修饰具有更强的体内外光敏抗肿瘤活性[12-13]，据此，本文以蚕沙叶绿素a粗提物（糊状叶绿素）酸水解产物脱镁叶绿酸a（5）经强碱条件下通空气氧化降解制得的4[14]为先导，通过碱水解及CH2N2甲基化制得的二氢卟吩p6三甲酯（2）为关键中间体，与33% HBr加成后再和烷氧醇发生亲核取代而设计合成化学性质稳定的二氢卟吩p6醚类衍生物1a-1f，以期筛选获得高效、低毒的PDT治癌药物候选化合物，合成路线见图1。

1 化学实验

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

核磁氢谱（1H NMR）和碳谱（13C NMR）用Bruker MSL-300和600型核磁共振仪测定，TMS为内标；电喷雾质谱（ESI-MS）用API-3000LC-MS型质谱仪测定；高分辨质谱（ESIHRMS）用Agilent 6538 UHD Accurate-Mass QTOF LC/MS型质谱仪测定。紫外谱（UV）用岛津UV-160型紫分光光度计测定。

1.1.2 试剂

柱层析硅胶H（60型）由青岛海洋化工集团公司出品。糊状叶绿素由浙江省海宁市天然色素厂生产。脱镁叶绿酸a（5）和紫红素-18（4）均按文献[14]方法制备。其余所用化学试剂和溶剂均为市售化学纯商品。

1.2 二氢卟吩p6醚类衍生物（1a-1f）的合成

1.2.1 二氢卟吩p6三甲酯（2）的合成

取化合物4（1.0 g，1.77 mmol）溶于四氢呋喃（THF）（25 ml），加甲醇（100 ml）和0.5 M NaOH水溶液（125 ml），室温搅拌反应45 min，用稀H2SO4调节pH至5～6，乙醚萃取（50 ml×3），无水Na2SO4干燥，乙醚液于冰盐浴条件下加入新鲜配制的2.8%（W/V）重氮甲烷乙醚液（CH2N2-Et2O）（10 ml），反应5 min，加少量乙酸，水洗，减压回收溶剂，硅胶H柱色谱分离得黑色粉末2（0.92 g），产率83.2%。UV-vis λmax(THF, nm)：666, 611, 530,501, 402。1H NMR (CDCl3, δ, ppm)：9.96 (s, 1H, 10-H), 9.38 (s, 1H, 5-H), 8.68 (s, 1H, 20-H), 7.92 (dd,1H,J=17.9 and 11.5 Hz, 31-H), 6.28 (d, 1H,J=17.9 Hz,32-HB), 6.10 (d, 1H,J=11.5 Hz, 32-HA), 4.46 (m, 2H,17-H and 18-H), 4.24 (s, 3H, 151-OCH3), 4.20 (s, 3H,131-OCH3), 3.88 (s, 3H, 173-CH3), 3.59 (s, 3H, 12-CH3), 3.38 (s, 3H, 7-CH3), 3.18 (s, 3H, 2-CH3), 3.55(q, 2H,J=7.5 Hz, 81-CH2), 2.51～2.10 (m, 4H, 17-CH2CH2), 1.85 (d, 3H,J=7.2 Hz, 18-Me), 1.62 (t, 3H,J=7.5 Hz, 82-Me)。MS (ESI+)m/z：625.48 [M+H]+(100%)。

1.2.2 3-去乙烯基-3-(1-甲氧基)乙基二氢卟吩p6-13,15-二甲酯（1a）的合成

取化合物2（100 mg, 0.16 mmol），磁力搅拌下用注射器缓慢加入33%氢溴酸冰醋酸溶液（20 ml），避光密封条件下室温继续搅拌反应36 h。反应完毕，减压蒸除过量氢溴酸和冰醋酸得黑色固体。所得黑色固体溶于干燥CH2Cl2（50 ml），加入K2CO3（100 mg）和干燥甲醇（2 ml），氮气保护下搅拌室温反应2.5 h。反应完毕，加3倍量水，分取有机层，水洗3次，减压回收CH2Cl2，硅胶H柱色谱分离（洗脱剂：二氯甲烷/甲醇/丙酮/甲酸=100/2/2/0.1），得黑色固体产物1a，34.6 mg，收率32.7%。UV-vis λmax(THF, nm)：662, 608, 525, 497, 397。1H NMR(300 MHz, DMSO-d6, δ, ppm): 12.08 (s, 1H, CO2H),9.79 (s, 2H, 10- and 5-H), 8.98 (s, 1H, 20-H), 5.97(m, 1H, 31-H), 4.99 (m, 1H, 17-H), 4.55 (m, 1H, 18-H), 4.14 (s, 3H, 151-OCH3), 4.10 (s, 3H, 131-OCH3),3.73 (m, 2H, 81-CH2), 3.60 (s, 3H, 12-CH3), 3.47 (s,3H, 31-OCH3), 3.30 (s, 3H, 7-CH3), 3.21 (s, 3H, 2-CH3), 2.35 (m, 2H, 172-CH2), 2.15 (m, 2H, 171-CH2),2.00 (d, 3H, 18-CH3), 1.78 (d, 3H, 32-CH3), 1.61 (t,3H, 82-CH3), -1.16 (s, 1H, NH), -1.30 (s, 1H, NH)。MS (ESI+)m/z: 643.73 [M+H]+(100%)； (ESI-)m/z:641.62 [M-H]-(100%)； HRMS (ESI-)m/z: 642.3059[M]-, calcd for C36H42N4O7642.3053。

1.2.3 3-去乙烯基-3-(1-乙氧基)乙基二氢卟吩p6-13,15-二甲酯（1b）的合成

同1a合成操作，由化合物2（100 mg, 0.16 mmol）和33%氢溴酸冰醋酸溶液（20 ml）反应得到的氢溴酸加成物与无水乙醇（2 ml）反应制得黑色固体产物1b，收率28.2%。UV-vis λmax(THF, nm)：662,606, 577, 499, 398。MS (ESI+)m/z: 657.50 [M+H]+(100%)。1H NMR [300 MHz, DMSO-d6, δ, ppm]:12.07 (s, 1H, CO2H), 9.62 (s, 1H, 10-H), 9.06 (s, 1H,5-H), 8.82 (s, 1H, 20-H), 5.91 (m, 1H, 31-H), 4.92 (m,1H, 17-H), 4.51 (m, 1H, 18-H), 4.32 (s, 3H, 151-OCH3), 4.15 (s, 3H, 131-OCH3), 3.69 (m, 2H, 81-CH2), 3.58 (s, 3H, 12-CH3), 3.45 (m, 2H, 31-OCH2CH3), 3.33 (s, 3H, 7-CH3), 3.22 (s, 3H, 2-CH3),2.32 (m, 2H, 172-CH2), 2.21 (m, 2H, 171-CH2), 1.96(d, 3H, 18-CH3), 1.83 (d, 3H, 32-CH3), 1.63 (t, 3H, 82-CH3), 0.91 (m, 3H, 31-OCH2CH3), -1.01 (s, 1H, NH),-1.26 (s, 1H, NH)。

1.2.4 3-去乙烯基-3-(1-正丙氧基)乙基二氢卟吩p6-13,15-二甲酯（1c）的合成

同1a合成操作，由化合物2（100 mg, 0.16 mmol）和33%氢溴酸冰醋酸溶液（20 ml）反应得到的氢溴酸加成物与无水正丙醇（2 ml）反应制得黑色固体产物1c，收率32.1%。UV-vis λmax(THF, nm)：661,578, 543, 499, 400。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6,δ, ppm): 12.06 (s, 1H, CO2H), 9.85 (s, 1H, 10-H),9.72 (s, 1H, 5-H), 8.97 (s, 1H, 20-H), 5.96 (m, 1H, 31-H), 4.99 (m, 1H, 17-H), 4.57 (m, 1H, 18-H), 4.14 (s,3H, 151-OCH3), 4.12 (s, 3H, 131-OCH3), 3.69 (m, 2H,81-CH2), 3.57 (s, 3H, 12-CH3), 3.38 (m, 2H, 31-OCH2C2H5), 3.30 (s, 3H, 7-CH3), 3.16 (s, 3H, 2-CH3), 2.37 (m, 2H, 172-CH2), 2.13 (m, 2H, 171-CH2),1.97 (d, 3H, 18-CH3), 1.80 (d, 3H, 32-CH3), 1.64 (t,3H, 82-CH3), 1.56 (m, 2H, 31-OCH2CH2CH3), 0.89 (t,3H, 31-OCH2CH2CH3), -1.13 (s, 1H,, NH), -1.28 (s,1H,, NH)。MS (ESI+)m/z: 671.46 [M+H]+(100%)；MS (ESI-)m/z: 669.48 [M-H]-(100%)。

1.2.5 3-去乙烯基-3-(1-正丁氧基)乙基二氢卟吩p6-13,15-二甲酯（1d）的合成

同1a合成操作，由化合物2（100 mg, 0.16 mmol）和33%氢溴酸冰醋酸溶液（20 ml）反应得到的氢溴酸加成物与无水正丁醇（2 ml）反应制得黑色固体产物1d，收率27.8%。UV-vis λmax(THF, nm)：661,579, 545, 498, 400。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6,δ, ppm): 12.02 (s, 1H, CO2H), 9.83 (s, 1H, 10-H),9.66 (s, 1H, 5-H), 8.98 (s, 1H, 20-H), 5.88 (m, 1H, 31-H), 5.05 (m, 1H, 17-H), 4.58 (m, 1H, 18-H), 4.16 (s,3H, 151-OCH3), 4.15 (s, 3H, 131-OCH3), 3.58 (m, 2H,81-CH2), 3.55 (s, 3H, 12-CH3), 3.47 (m, 2H, 31-OCH2C3H7), 3.35 (s, 3H, 7-CH3), 3.10 (s, 3H, 2-CH3), 2.40 (m, 2H, 172-CH2), 2.12 (m, 2H, 171-CH2),1.92 (d, 3H, 18-CH3), 1.83 (d, 3H, 32-CH3), 1.68 (t,3H, 82-CH3), 1.60-1.30 (m, 4H, 31-OCH2(CH2)2CH3),0.72 (t, 3H, 31-OCH2CH2CH2CH3), -1.13 (s, 1H,NH), -1.25 (s, 1H, NH)。13C NMR (600 MHz,DMSO-d6, δ, ppm): 174.91, 174.38, 170.22, 167.59,166.58, 145.46, 141.12, 140.85, 137.70, 136.20,135.17, 134.73, 132.66, 129.09, 112.95, 104.73,103.70, 101.03, 94.46, 72.41, 68.82, 53.24, 52.90,52.73, 48.81, 41.72, 34.11, 32.22, 31.91, 29.23,24.83, 23.89, 21.82, 19.49, 19.09, 17.90, 14.13,12.49, 11.09。MS (ESI+)m/z: 685.49 [M+H]+(100%)； MS (ESI-)m/z: 683.43 [M - H]-(52%),1367.12 [2M - H]-(100%)。

1.2.6 3-去乙烯基-3-(1-正戊氧基)乙基二氢卟吩p6-13,15-二甲酯（1e）的合成

同1a合成操作，由化合物2（100 mg, 0.16 mmol）和33%氢溴酸冰醋酸溶液（20 ml）反应得到的氢溴酸加成物与无水正戊醇（2 ml）反应制得黑色固体产物1e，收率26.7%。UV-vis λmax(THF, nm)：661,581, 542, 499, 401。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6,δ, ppm): 12.01 (s, 1H, CO2H), 9.87 (s, 1H, 10-H),9.78 (s, 1H, 5-H), 8.97 (s, 1H, 20-H), 5.96 (m, 1H, 31-H), 4.99 (m, 1H, 17-H), 4.56 (m, 1H, 18-H), 4.15 (s,3H, 151-OCH3), 4.12 (s, 3H, 131-OCH3), 3.66 (m, 2H,81-CH2), 3.60 (s, 3H, 12-CH3), 3.49 (m, 2H, 31-OCH2C4H9), 3.38 (s, 3H, 7-CH3), 3.19 (s, 3H, 2-CH3), 2.36 (m, 1H, 172-CH2), 2.06 (m, 2H, 171-CH2),1.99 (d, 3H, 18-CH3), 1.80 (d, 3H, 32-CH3), 1.66 (t,3H, 82-CH3), 1.60-1.28 (m, 6H, 31-OCH2(CH2)3CH3),0.74 (t, 3H, 31-OCH2CH2CH2CH2CH3), -1.14 (s, 1H,NH), -1.27 (s, 1H, NH)。13C NMR (600 MHz,DMSO-d6, δ, ppm): 174.91, 174.34, 170.17, 167.49,166.57, 145.71, 140.90, 137.69, 136.40, 135.20,132.73, 129.02, 12.91, 104.92, 103.60, 101.11, 94.43,72.44, 72.39, 69.14, 53.24, 52.81, 52.72, 48.72,34.16, 31.68, 31.33, 29.84, 29.39, 28.57, 25.61,24.55, 23.47, 22.10, 19.19, 18.06, 14.24, 12.54,11.30, 11.12。MS (ESI+)m/z: 699.52 [M+H]+(100%)； MS (ESI-)m/z: 697.41 [M-H]-(67%),1395.16 [2M-H]-(100%)。

1.2.7 3-去乙烯基-3-(1-正己氧基)乙基二氢卟吩p6-13,15-二甲酯（1f）的合成

同1a合成操作，由化合物2（100 mg, 0.16 mmol）和33%氢溴酸冰醋酸溶液（20 ml）反应得到的氢溴酸加成物与无水正己醇（2 ml）反应制得黑色固体产物1f，收率36.3%。UV-vis λmax(THF, nm)：660,582, 544, 498, 401。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6,δ, ppm): 12.07 (s, 1H, CO2H), 9.81 (s, 1H, 10-H),9.67 (s, 1H, 5-H), 8.95 (s, 1H, 20-H), 5.87 (m, 1H, 31-H), 5.02 (m, 1H, 17-H), 4.56 (m, 1H, 18-H), 4.15 (s,3H, 151-OCH3), 4.13 (s, 3H, 151-OCH3), 3.55 (s, 3H,12-CH3), 3.51 (m, 2H, 81-CH2), 3.37 (m, 2H, 31-OCH2C5H11), 3.34 (s, 3H, 7-CH3), 3.11 (s, 3H, 2-CH3), 2.40～2.10 (m, 4H, 17-CH2CH2), 1.93 (d, 3H,18-CH3), 1.81 (d, 3H, 32-CH3), 1.68 (t, 3H, 82-CH3),1.52 (m, 3H), 1.52～1.47 (m, 8H, 31-OCH2(CH2)4CH3),0.56 (t, 3H, 31-O(CH2)5CH3), -1.13 (s, 1H, NH), -1.27(s, 1H, NH)。13C NMR (600 MHz, DMSO-d6, δ,ppm): 173.84, 173.48, 169.72, 166.87, 166.10,154.25, 148.25, 145.10, 140.48, 137.06, 135.85,134.65, 134.00, 132.10, 128.50, 122.41, 104.30,103.11, 100.67, 93.80, 71.90, 68.61, 53.24, 52.70,52.38, 48.28, 31.24, 30.95, 29.54, 28.76, 25.44,24.41, 23.36, 21.85, 18.61, 17.45, 13.57, 11.97,10.57。MS (ESI+)m/z: 713.45 [M+H]+(100%)。

2 体外光动力抗肿瘤活性测试

2.1 实验方法

2.1.1 细胞培养

小鼠黑色素B16-F10细胞（中科院上海细胞库）在含2 mg/ml 的碳酸氢钠、4.5 mg/ml葡萄糖、100 μg/ml链霉素硫酸盐、40 mg/ml庆大霉素、100 U/ml青霉素、10%（V/V）热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基（Hyclone, Logan, UT, USA）中，置于5%CO2温度为37 ℃的恒温培养箱中培养。

2.1.2 细胞暗毒性

于96孔板上每孔接种5×103个B16-F10细胞，按“2.1.1”项条件培养。取待测样品配成已知浓度的二甲基亚砜待测液，用PBS稀释成不同浓度后加入细胞培养液，继续培养48 h。将细胞培养液吸出，加入含10%（V/V）CCK-8（Dojindo Laboratories,Japan）的培养液200 μl，继续培养1.5 h，然后用酶标仪（Tecan, Switzerland）与波长450 nm处测定每孔的吸光度值，相应测算细胞存活率，并计算各待测样品的半数抑制肿瘤生长浓度（IC50值）。

2.1.3 细胞光毒性

于96孔板上每孔接种5×103个B16-F10细胞，按“2.1.1”项条件培养，加入已知浓度的待测样品，培养24 h。然后用678 nm波长的光照射，光剂量10 J/cm2，继续培养24 h。再按“2.1.2”项所述CCK-8法测定细胞存活率，并计算各待测样品的IC50值。

2.2 活性测试结果

以临床光敏药物维替泊芬和他拉泊芬为阳性对照药，受试化合物对小鼠黑色素B16-F10细胞的PDT抗癌活性结果见表1。

表1 目标化合物对B16-F10细胞的PDT抗癌活性

3 结果与讨论

以蚕沙叶绿素a粗提物（糊状叶绿素）酸碱氧化降解产物紫红素-18（4）为先导物，经氢溴酸加成和烷氧醇取代反应成功合成得到了二氢卟吩p6醚类光敏剂1a-1f（图1），但两步反应总收率偏低，仅为22.2%～30.2%，需要开展后续合成工艺优化研究。

目标化合物1a-1f的结构经ESI-MS、1H NMR、13C NMR及ESI-HRMS确证。由表1结果可见，所有目标化合物对小鼠黑色素B16-F10细胞的光毒性随醚键碳链增长而增强（1f≥1e＞1d＞1c≥1b＞1a），相比临床同类光敏药物维替泊芬和他拉泊芬分别强4.2～7.2倍和29.3～49.8倍，且均具有更高的暗毒/光毒比，提示二氢卟吩p6醚类光敏剂具有光动力抗癌活性强、治疗指数（暗毒/光毒比）高等优点，值得开发研究。