白细胞介素-32和胸腺基质淋巴细胞生成素在特应性皮炎患者外周血中的表达

田兰馨，徐 慧，彭 柔， 慈 雪，王秀敏

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，患者往往有剧烈瘙痒，严重影响生活质量。近年来随着对AD 免疫机制的深入研究，揭示AD 是炎症反应恶性循环的结果。Th1/Th2 细胞失衡被认为是AD 发病的主要机制，在急性期以Th2 细胞反应为主，介导体液免疫；慢性期时，以Thl 细胞反应为主，参与细胞免疫反应。白细胞介素（IL）是一类可以在白细胞及免疫细胞间相互作用的细胞因子，在介导T 淋巴细胞和B 淋巴细胞活化、增殖与分化及炎症反应中起重要作用。IL-32 作为一种多向性的促炎性反应的细胞因子，在增强炎症的反应上扮演重要的角色。主要通过增加多种炎性细胞因子的分泌以及促进细胞向炎症区迁徙而发挥作用。胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）属IL-7 家族成员，在皮肤黏膜天然免疫中起重要作用。研究发现AD患者皮损处角质形成细胞（keratinocyte，KC）可高表达TSLP，而AD 患者非皮损处皮肤则几乎不表达TSLP[1]。还有研究发现IL-32 可以通过 caspase-1 和核转录因子-κB（NF-κB）途径上调 TSLP 的表达，且这两个因子均能通过介导相关因子的表达，来调节T 淋巴细胞的增殖和分化。因此两者在Th1、Th2、Th17 及其他 Th 细胞亚群的平衡调节中，起到一定的协同作用，共同参与变应性炎症反应[2]。目前为止，在AD 患者中，两者的关系及表达意义国内报道较少，本研究通过检测48 例AD 患者治疗前后外周血IL-32、TSLP 的表达水平及与病情严重程度的相关性分析，探讨两者在AD 发病中的作用。

1 病例与方法

1.1 病例

试验组选取医院皮肤科门诊2017 年1 月―2017年11 月就诊的确诊为AD 的患者，诊断均符合AD的Williams 诊断标准[3]。选取患者48 例，其中男25例，女23 例，年龄8 ～27 岁，平均（17±1.84）岁，病程2 个月～17 年，所有受检患者近3 个月未接受糖皮质激素、免疫抑制剂、紫外线等系统治疗。健康对照选取2017 年1 月―2017 年10 月来自滨州地区中小学及大学的健康志愿者30 例，男14 例，女16 例，年龄10 ～23 岁，平均（16±2.28）岁，体格检查及实验室检查均正常。无系统性疾患，近期没有局部和全身的感染性疾患，均无过敏性疾病史。两组在性别、年龄等方面差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，受试者均已签署知情同意书。

1.2 试剂

人 TSLP 酶联免疫吸附试验（ELISA） 试剂盒及人IL-32 ELISA 试剂盒（上海羽朵生物科技有限公司），他克莫司软膏（儿童浓度0.03%，成人浓度0.1%）（安斯泰来制药有限公司）及复方甘草酸苷胶囊（北京凯因科技股份有限公司）。

1.3 标本收集及IL-32、TSLP水平测定

健康对照组及试验组治疗前与治疗8 周后抽取空腹静脉血5 ml，分离血清。采用竞争性抑制法ELISA 检测IL-32、TSLP 水平。具体操作步骤按试剂盒说明进行。

1.4 给药方法及疗效判定

外用他克莫司软膏，每日2 次外用，疗程为8周；口服复方甘草酸苷胶囊，每日3 次，每次3 粒（16 岁以下儿童1 次1 粒，每日3 次），疗程为8 周。在治疗前及治疗8 周后分别计算AD 病情严重程度（SCORAD）评分。

1.5 疗效观察指标及评分标准

在治疗前及治疗后采用欧洲AD 评分标准SCORAD 评估患者疾病严重程度。SCORAD 评分标准包括皮肤病变范围(A)和皮损严重程度(B)和主观症状(C)——瘙痒和睡眠影响程度。皮肤病变范围的面积评分：以l%的皮损面积计为1 分，其中手部包括腕部，足部包括踝部，躯干包括臀部。瘙痒和睡眠影响程度评分：按最近的3 昼夜平均来评分，各评分分为0 ～10 分，0 分为无瘙痒或睡眠无影响，10 分为患者所能想像最严重的瘙痒或根本无法入睡。总分计算公式：总分=A/5+7B/2+C。总分范围为0～103分，＜25 分为轻度，25 ～50 分为中度，＞50 分为重度。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 两组患者临床疗效评估

试验组48 例患者均按要求完成规定疗程，2 例患者出现轻微皮肤发红伴烧灼感，考虑与他克莫司刺激有关，适度冷敷后症状缓解，未影响治疗。治疗前SCORAD 评分（51.53±16.89）分，明显高于治疗后（28.53±11.27）分，差异具有统计学意义（t=7.73，P＜0.01）。

2.2 两组患者血清IL-32、TSLP水平

AD 患者血清IL-32 表达水平明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（t=17.65，P＜0.01）。治疗前后比较：治疗前外周血血清IL-32 表达水平显著高于治疗后，差异具有统计学意义（t=16.77，P＜0.01）；治疗后外周血清IL-32 水平高于正常组，差异无统计学意义（t=1.81，P＞0.05）（表1，图1）。

AD 患者血清TSLP 表达水平明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（t=28.01，P＜0.01）。治疗前后比较，治疗前外周血血清TSLP 表达水平显著高于治疗后，差异具有统计学意义（t=21.45，P＜0.01）；治疗后外周血清TSLP 水平高于正常组，差异有统计学意义（t=9.46，P＜0.01）（表1，图2）。

表1 AD患者血清IL-32和TSLP水平的检测结果（±s，pg/ml）

表1 AD患者血清IL-32和TSLP水平的检测结果（±s，pg/ml）

组 别 例数 IL-32 TSLP试验组治疗前 48 75.65±12.47 99.77±11.95治疗后 48 40.29± 7.61 51.27±10.12对照组 30 37.22± 6.71 30.71± 7.90

图1 AD患者血清IL-32水平检测

图2 AD患者血清TSLP水平检测

2.3 相关性分析

本实验中AD 患者治疗前的血清TSLP 水平与SCORAD 评分之间有相关性，为正相关（r= 0.57，P＜0.05）。AD 患 者 治 疗 前 的 血 清IL-32 水 平 与SCORAD 评分之间无直线相关性（r=0.29，P＜0.05）。治疗前IL-32 与 TSLP 血清水平之间有相关性，为正相关（r= 0.52，P＜0.01），见表2 及图3。

表2 AD患者外周血各细胞因子及SCORAD评分的相关性

3 讨论

IL-32 的基因最早是在1992 年从自然杀伤（NK）细胞中克隆出来，当时命名为NK4（natural killer cell transcript 4），但其功能未知。 2005 年Kim 等[4]利用生物芯片技术研究IL-18 诱导高表达基因，从中发现一个高表达的细胞因子样基因，命名为IL-32。IL-32主要是由NK 细胞、T 淋巴细胞、上皮细胞及外周血中的单核细胞产生。Meyer 等[5]在研究中发现，人初始KC 可以表达IL-32，且受到干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α 的刺激后增加，其与KC 的凋亡密切相关。同时发现AD 患者皮损表面 IL-32 的表达较健康人皮肤处升高，而且IL-32 血清水平和AD 患者病情严重程度呈正相关，国内少见相关报道。TSLP 属IL-7 家族成员，其受体由IL-17Rα 和TSLPR 组成，属于Th2 型细胞因子。TSLP 可由皮肤的KC、黏膜上皮细胞、肥大细胞产生，在皮肤黏膜天然免疫中起重要作用。TSLP 可以通过TSLP-DC-OX40L 轴在患者体内产生一系列Th2 细胞介导的级联反应，这些均提示TSLP 是启动AD Th2 型免疫反应的“重要开关”[6]。近年来国外研究表明TSLP 不仅可以启动AD 患者Th2 型的免疫反应，而且可以直接刺激感觉神经引起瘙痒[7,8]。另外，TSLP 目前被发现是预测婴儿AD 发生发展的重要生物学标志，高水平的TSLP 表达对有家族史的受试者进一步提升了它的预测价值[9]。本实验旨在研究IL-32、TSLP 相关通路在AD 发病机制中的作用，为AD 未来的靶向治疗提供新的思路。

图3 AD患者IL-32和TSLP水平与SCORAD评分之间的相关性

相关研究已证明IL-32 可以通过 caspase-1 和NF-κB 途径介导 Th2 细胞表达TSLP，IL-32 可以通过上调 TSLP 的表达，来促使炎症反应的发生，而随着 TSLP 的耗竭或通过抑制 caspase-1 来减弱IL-32-TSLP 这一通路的作用，便可以抑制炎症反应[1]。这与本实验的结果相符，两者在AD 患者中的血清水平较正常对照组均明显升高，且二者关系呈显著正相关。此外，TSLP 激活的树突状细胞（TSLP-DCs）可选择性表达 OX40L，OX40L 与受体 OX40 结合，在不同微环境下发挥不同的生物学功能。在有关实验中，笔者了解到湿疹患者外周血中 IL-32 mRNA与 OX40L mRNA 的表达水平呈正相关，提示在湿疹的发病过程中，IL-32 可能先通过激活 NF-κB 和caspase-1 途径上调 TSLP 的表达，然后 TSLP-DCs 表达的OX40L 进一步产生生物学效应。此外，IL-32-TSLP 均能通过介导相关因子的表达，来调节T 淋巴细胞的增殖和分化，活化Th1 向Th2 细胞分化，从而促进Th2 细胞的生成并分泌Th2 型细胞因子和促炎性因子，促进lgE、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、肥大细胞等的产生，进而引起过敏性炎症反应。因此两者在Th 细胞亚群的平衡调节中，起到重要的协同作用。因而可以推测，IL-32-TSLP 可能成为湿疹、AD以及其他变态性炎症反应疾病的诊疗的一个新靶点，相关详细机制通路还需要进一步的研究。

他克莫司软膏是一种新型外用大环内酯类免疫调节剂，是治疗AD 的非皮质类固醇类外用制剂，疗效确切，不良反应较少。有研究证明其作用机制主要是通过抑制钙调磷酸酶而抑制激活性T 淋巴细胞的细胞核因子（nu-clear factorof activated T cells，NFAT）的转录，继而抑制T 淋巴细胞的活化及其介导的免疫炎症反应。它能有效地与细胞胞质内的FK506结合蛋白-12 结合并形成复合物，竞争性地结合钙调蛋白的钙调神经磷酸酶，抑制酶活性，最终抑制与特应性皮炎发病相关的细胞因子生成，这一作用是选择性地针对AD 发病机制的核心[10]。且他克莫司不会抑制胶原合成，故长时间使用不会导致用药部位皮肤出现萎缩和增加感染发生概率，安全性较高，用于维持性治疗AD 的优势十分显著。他克莫司的免疫调节作用除了通过经典的抑制T 淋巴细胞内钙调磷酸酶的活性而抑制大量的与Th2 和Th1 细胞相关的细胞因子的表达外，还能直接或间接抑制与炎症反应起始有关的KC 转录因子NF-κBp50 和NF-κBp65 的活化，进而抑制NF-kB 调控的促炎细胞因子、趋化因子和协同刺激分子表达，产生抗天然免疫炎症反应的作用。IL-32 转导的通路中包括NF-κB 通路，IL-32 与相应受体结合激活NF-κB 通路，影响多种细胞因子、黏附因子、免疫受体、急性时相蛋白、应激反应蛋白基因的转录，且IL-32 可以通过NF-κB 途径介导 Th2细胞表达TSLP，影响AD 炎症反应。

复方甘草酸苷是以甘草中的活性物质为主要成分的复方制剂，具有抗炎、抗过敏及类固醇样作用和免疫调节作用，可调节T 淋巴细胞活化，诱发IFN-γ产生，活化NK 细胞以及抗病毒作用。它还可使血清中IgE 明显下降乃至正常。此外可以调节机体的免疫功能，促使免疫细胞增强活性，提升患者对于外界刺激的抵抗力和免疫功能，促使细胞免疫代谢功能恢复正常，达到减少过敏反应的目的，且明显缓解变应性炎症性皮肤病的临床症状。

本实验中，AD 患者在使用他克莫司软膏和复方甘草酸苷胶囊治疗后，IL-32、TSLP 的血清水平以及SCORAD 评分明显下降，较治疗前差异具有统计学意义，这进一步印证了各种刺激诱发的KC 的NF-κB 过度活化可作为启动或维持AD 炎症反应的基础。而他克莫司软膏不仅通过经典的抑制T 淋巴细胞活化而抑制Th2 和Th1 的免疫炎症反应，还可以通过抑制炎症反应的上游激活时间而间接调控与天然免疫反应密切相关的中心转录因子NF-κB 的核表达或活化，进而调控与之有关的通路引起的皮肤天然免疫炎症反应。

本研究结果显示，IL-32、TSLP 均在AD 发病过程中起重要的作用。他克莫司联合复方甘草酸苷治疗后，二者血清水平明显下降，推测IL-32-TSLP 可能成为AD及其他变应性炎症性疾病治疗的一个新靶点，但由于IL-32 和TSLP 各自与受体结合后作用的多样化，两分子间相互作用的更多机制还有待今后进一步探究。