尼莫地平对脑出血大鼠脑组织含水量及白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α的影响

李万奎，杨惠然，黄杰

(1.河南圣德医院 神经内科，河南 信阳 464000；2.信阳职业技术学院 a.医学部;b.体育部，河南 信阳 464000)

近年来研究表明，脑出血后由于释放细胞毒性物质、凝血酶及其他代谢产物，造成细胞内钙超载，血脑屏障破坏，炎症因子大量释放，从而导致脑水肿及神经细胞损伤[1]。在这些炎症因子中，以白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)关系最为密切[2]。钙离子通道作为细胞信号转导的第二信使，在脑出血后神经功能损伤中起重要作用[3]。尼莫地平是新一代二氢吡啶类钙通道阻滞剂，具有较好的脂溶性，可透过血脑屏障，已广泛应用于脑出血的临床治疗。本研究采用注入自体血的方法建立大鼠脑出血模型，给予尼莫地平干预，通过观察大鼠脑组织含水量及脑组织匀浆液中IL-6、TNF-α含量，探讨尼莫地平对脑出血后脑水肿、炎症因子的影响及其可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 实验资料

1.1.1药物 尼莫地平标准品(中国药品生物制品检定所)。

1.1.2器材 立体定向仪、微量注射仪(瑞沃德生命科技有限公司)，微量注射器(上海高鸽工贸有限公司)，电子天平(上海精科天平)，电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械有限公司)，721分光光度计(上海湖光科技仪器厂)，酶标仪(北京市六一仪器厂)。

1.1.3试剂 IL-6试剂盒、TNF-α试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.4实验对象 健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，雌雄不限，体质量为250～300 g，许可证号为SCXK(豫)2017-0001，由信阳职业技术学院实验动物中心提供，购自河南省实验动物中心。本研究方案由河南省实验动物中心实验动物伦理委员会审查和批准，所有试验均遵照《实验动物环境及设施GB 14925-2010》，遵守实验动物福利与伦理原则。

1.2 实验方法

1.2.1分组与造模 将大鼠以随机数表法分为假手术组、脑出血模型组和尼莫地平治疗组，每组24只。模型组采用Fredrik法[4]取自体股动脉血50 μL注入大鼠基底节区复制实验性脑出血模型。尼莫地平治疗组在造模后予以尼莫地平5 mg·kg-1腹腔注射治疗，每12 h注射1次，直至处死前12 h。假手术组制备过程相同，基底节区注入等体积9 g·L-1的NaCl溶液。术后72 h时，断头处死大鼠，做相关指标检测。

1.2.2检测方法

1.2.2.1脑组织含水量观察 脑组织含水量采用干湿重法[5]测定：每组各取12只大鼠，断头处死后迅速取脑组织(去除脑干、小脑及嗅球)，将取出的脑组织放在9 g·L-1的NaCl溶液湿润的滤纸培养皿中，以防水分蒸发。去除脑皮质表面的脑膜和血块，滤纸吸干表面水分，迅速放入预先称重(A)带瓶塞的玻璃瓶中，立即称重(B)，B-A即得湿重。去掉瓶塞，放入70 ℃恒温干燥箱中烘干72 h，取出脑组织，待其恢复到室温，再将瓶塞扣紧称重(C)，C-A即得干重。脑组织含水量(%)=(脑组织湿重-脑组织干重)/湿重×100%，即(B-C)/(B-A)×100%。

1.2.2.2IL-6、TNF-α含量测定 再取各组12只大鼠，冰上断头处死，迅速取血肿边缘脑组织约0.2 g，分离后称重，用9 g·L-1的NaCl溶液除去血液，滤纸吸干，放入5 mL小烧杯中，加入适量冰盐水。将脑组织放入玻璃匀浆器中进行匀浆，充分研磨脑组织，制成40%脑组织匀浆液，4 ℃，每分钟3 000转，离心30 min，取上清液置-20 ℃冰箱中保存，酶联免疫法测定按试剂盒说明书方法操作，计算出样品含量。

2 结果

2.1 脑组织含水量脑出血模型组脑组织含水量为(83.71±4.89)%，高于假手术组的(73.19±3.33)%，差异有统计学意义(P=0.008 1)。尼莫地平治疗组脑组织含水量为(78.79±3.59)%，低于脑出血模型组的(83.71±4.89)%，差异有统计学意义(P=0.034 2)。

2.2 IL-6和TNF-α含量脑出血模型组脑组织匀浆液IL-6、TNF-α高于假手术组，差异有统计学意义(P=0.006 4、0.007 3)。尼莫地平治疗组脑组织匀浆液IL-6、TNF-α低于脑出血模型组，差异有统计学意义(P=0.034 5、0.017 1)。见表1。

表1 各组IL-6和TNF-α测定结果比较

注：与假手术组比较，aP<0.05；与脑出血模型组比较，bP<0.05；IL-6—白细胞介素-6；TNF-α—肿瘤坏死因子-α。

3 讨论

目前认为，脑出血后血肿边缘存在的水肿，既有血管源性水肿，又有细胞源性水肿[6]。脑水肿的产生除了因细胞内钙超载致使受钙调节的磷脂酶、蛋白酶、核酸内切酶等被激活而导致血脑屏障破坏外[7]，还与脑出血后产生的炎症因子IL-6、TNF-α等的释放有关[8-9]。在中枢神经系统，IL-6主要源于巨噬细胞、神经内皮细胞、有活性的星形胶质细胞及小胶质细胞等。研究发现，IL-6对中枢神经系统既有神经保护作用，又有神经毒性作用，正常情况下，神经细胞中低水平IL-6发挥中枢介导、神经修复等生理作用，但脑出血后IL-6表达异常增高，参与神经细胞的损伤过程[10]。异常升高的IL-6可抑制前列腺素E2的产生，引起血管收缩，加重脑水肿，增加细胞间黏附分子的表达，导致微循环障碍，加重血脑屏障破坏和神经功能损害[11]。IL-6作为重要的炎症因子，反映急性脑血管疾病的促炎状态，可作为患者预后判断的一个独立指标[12]。在正常情况下，外周巨噬细胞分泌的TNF-α不能通过血脑屏障，但在脑出血等中枢神经系统受损后，由于血脑屏障的破坏，致使TNF-α可进入中枢神经系统。TNF-α是一种具有广泛生物学功能的细胞因子，可通过促进凝血、增加内皮细胞通透性及诱导黏附分子或其他炎症介质的表达，增加血脑屏障的通透性，加重脑损伤[13]。大量研究表明，脑出血后血肿周围脑组织TNF-α mRNA蛋白表达升高[14-15]。作为钙离子拮抗剂的尼莫地平，可有效地减轻神经细胞内钙超载，减轻病灶部位的血管痉挛[16]，提高脑出血后局部血流量[17]，保护血脑屏障，缓解脑出血后脑水肿，从而保护神经细胞及神经胶质细胞结构和功能。本研究中，脑出血模型组脑含水量升高，IL-6和TNF-α水平亦升高，说明脑出血后，除了引起脑组织水肿，还引起炎症介质的释放。尼莫地平组大鼠脑组织含水量及脑组织匀浆中IL-6、TNF-α降低，说明尼莫地平不仅可改善脑水肿，还可抑制炎症反应。杨燚等[18]研究表明，大鼠脑梗死后出血脑水肿高峰期与IL-6、TNF-α表达高峰时间基本一致，说明IL-6和TNF-α介导了脑梗死后出血脑组织炎症反应，参与了脑水肿的发生和神经功能的损害。

综上，尼莫地平可有效减轻脑水肿，减轻脑出血后异常产生IL-6和TNF-α对脑组织的损害，抑制炎症反应。但是抑制炎症反应这一疗效是因尼莫地抑制钙超载引起，还是尼莫地平本身的其他药理作用，目前尚不清楚，还需要长时间、大样本、更深入的进一步研究。