比格犬慢性冬眠心肌模型的制备

高万里，张鹏飞，常志扬，魏志潘，臧小彪，王现青，张静，高传玉，赵永辉

(河南大学人民医院/华中阜外医院 a.心血管内科;b.超声科，河南 郑州 450003)

冠状动脉闭塞后，根据缺血的程度、速度、范围以及是否存在侧支循环，心肌细胞可能出现以下3种情况。(1)冬眠心肌：由长期的血流低灌注状态造成的静息状态下左心室功能持续低下，当冠状动脉血流恢复正常灌注后，收缩功能可完全或部分恢复，是心肌细胞应对缺血损伤的保护性机制。(2)顿抑心肌：心肌急性缺血缓解后，心肌细胞并未坏死，当冠状动脉供血恢复后，心肌收缩力和心肌代谢需要一定的时间才能恢复。冬眠心肌和顿抑心肌都具有收缩功能储备，属于存活心肌。(3)坏死心肌：心肌细胞已发生不可恢复的损伤，当冠状动脉恢复灌注后，心肌收缩力无法恢复，心功能亦不会改善。冬眠心肌由于恢复血供后可部分或完全恢复，具有重要的研究价值。

近年来，冬眠心肌成为了心血管领域的研究热点[1]，但经济且有效的冬眠心肌模型的制备方法尚未统一。查阅国内外文献可见，目前较常用的方法是球囊扩张+内膜剥脱，造成冠状动脉左前降支狭窄，亦有开胸后使用缩窄环造成慢性闭塞的模型[2-4]。但该研究方法缺乏准确的冠状动脉的闭塞百分比，对实验室及实验人员条件要求高，实验花费大，X线下对实验者有辐射伤害，动物死亡率高。本研究采用开胸法暴露犬冠状动脉左前降支中远段，用游标卡尺测量冠状动脉直径，采用不同粗细钢丝结扎，确保管腔狭窄程度在75%左右，以期为研究冬眠心肌提供简单易行的模型制备方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康成年比格犬16只，月龄为12～36个月，体质量为(11.2±1.9)kg，雌雄各半。所有动物研究完全符合国家《实验动物管理条例》。实验动物由南京亚东实验动物研究中心提供，编号：NO.201708679。将实验动物按照随机数表法分为A、B两组，A组为冬眠心肌模型组，B组为假手术组，每组8只。A组月龄为(16.1±3.1)个月，体质量为(11.8±1.2)kg；B组月龄为(15.9±2.5)个月，体质量为(12.0±1.0)kg。两组间体质量及月龄差异无统计学意义(均P>0.05)。

1.2 实验方法A组30 g·L-1戊巴比妥钠30 mg·kg-1静脉注射麻醉后，气管插管接麻醉呼吸机给予机械通气，连接多功能监护仪。触诊心尖搏动最强点，胸骨左缘第四肋间标记理想搏动点，常规备皮，消毒，铺巾，按标准外科程序开胸，打开心包，暴露冠状动脉左前降支(left anterior descending，LAD)中远段，无菌条件下使用游标卡尺测量靶血管直径，用带线缝合针(5-0)穿过靶血管下方心肌表面，绕过靶血管备结扎阻断，使用不同粗细钢丝将血管与钢丝紧密结扎，而后迅速抽出钢丝，确保结扎后造成靶血管70%～75%狭窄，观察临近靶血管供血区域血供情况，可见其心肌颜色较前稍有变浅。B组将丝线穿过前降支下方，但不结扎，其余同A组。术后连续3 d给予五水头孢唑琳0.5 g肌内注射，每日3次，预防切口感染。1周后开始进行加强运动训练，即实验犬每日运动量不少于4 h。术后3个月终止实验。

1.3 观察指标

1.3.1A组小剂量多巴酚丁胺负荷超声检测 正式实验前24～48 h，胸前壁备皮。用4.0 MHz电子相控阵扇扩探头在胸骨右缘进行体外超声扫查，取标准乳头肌水平左室短轴切面，对比观察左室前间壁(冬眠心肌)和后壁心肌(正常对照区)的收缩功能。采用M形取样线通过左室前间壁和后壁测定基础状态下和不同剂量多巴酚丁胺(2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg·kg-1·min-1，每期3 min)负荷时局部心肌的收缩功能。以收缩期室壁增厚率(wall thickening，WT%)表示心肌收缩功能。以静脉输液泵控制多巴酚丁胺剂量分别为2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg·kg-1·min-1[5-6]。

1.3.2静息时室壁运动分析 按照美国超声协会左心室16节段划分法，请两位主治及以上职称超声科医生以目测法观察LAD供血区室壁运动情况[7]：1分为运动正常，2分为运动幅度减低，3分为运动消失，4分为矛盾运动，即收缩期心外膜向外膨出，室壁变薄。室壁运动计分指数(wall molion score index，WMSI)=各节段记分之和/总节段数。正常值为1。

1.3.3左心室整体收缩功能测定 选取左室长轴切面图像，应用M型超声心动图连续测量3个不同心动周期的左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)，取平均值，比较术前、术后左心室整体收缩功能。

2 结果

2.1 模型制备概况本实验A组和B组共16只比格犬，均顺利完成实验，且A组造模成功，各项数据基本符合预期要求，无麻醉意外，无心肌梗死、感染等术后并发症。

2.2 A组超声心动图多巴酚丁胺负荷试验A组行超声心动图多巴酚丁胺负荷试验时，左室前间壁(冬眠心肌区域)与左室后壁(正常心肌区域)进行比较。随着多巴酚丁胺剂量增加，左室前间壁(冬眠心肌区域)收缩期WT%明显降低，且出现双向运动，即室壁运动随多巴酚丁胺剂量增加，先出现室壁运动增强，而后室壁运动减弱(均P<0.01)。随多巴酚丁胺剂量增加，左室后壁(正常心肌区域)室壁运动持续增强(均P<0.01)，冬眠心肌模型成功。见表1。A组小剂量多巴酚丁胺负荷左心室壁运动超声影像见图1。

表1 A组左室前间壁与左室后壁不同药物剂量下的WT%比较

注：与左室前间壁基础状态比较，aP<0.01；与左室后壁基础状态比较，bP<0.01。

A—多巴酚丁胺泵速为15 μg·kg-1·min-1；B—多巴酚丁胺泵速为20 μg·kg-1·min-1，室壁运动减弱，室壁厚度变薄；D1—左室前间壁厚度；D2—左室后壁厚度。

图1A组小剂量多巴酚丁胺负荷左心室壁运动超声影像

2.3 静息时室壁运动分析结果A组有较多节段出现室壁运动异常，B组未出现室壁运动异常，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 静息时心肌左心室壁节段障碍计分

注：A组与B组比较，P<0.01；WMSI—室壁运动计分指数。

2.4 左心室整体收缩功能测定A组术后左室收缩功能降低，表现为射血分数显著较少，B组术前术后未见明显变化，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3、图2和图3。

表3 两组手术前后慢性冬眠心肌心功能的变化比较

注：与同组术前比较，aP<0.01；与B组术后3个月比较，bP<0.01；LVEF—左室射血分数。

A—A组术前左心功能测定；B—A组术后左心功能测定；EF—左室射血分数。

图2A组手术前后左心功能比较

A—B组术前左心功能测定；B—B组术后左心功能测定；EF—左室射血分数。

图3B组手术前后左心功能比较

3 讨论

冬眠是心肌缺血时为了避免坏死采取的一种自我保护机制，及时恢复血供可以使缺血心肌功能恢复正常或接近正常，延期恢复血供可能使冬眠心肌功能慢性丧失[8-10]。心肌对慢性缺血的反应表现为一种适应的连续统一体，随着时间的推移，形成一种抗应激表型。有文献报道，其可以通过上调线粒体解偶联蛋白-2(UCP-2)，降低钙调蛋白表达，降低β受体密度等防止缺血引起的氧化应激，但是具体机制还有待进一步研究[11-12]。因此，合适的冬眠心肌模型是开展此实验的基础。

犬冬眠心肌模型制备具有天然的优势。比格犬体型适中，便于操作，其性格温顺，实验重复性好，适合循环生理、药理、病理等实验研究，比格犬冠状动脉侧支循环丰富，术中结扎血管不易因急性心肌缺血而诱发室速、室颤等恶性心律失常[13]。猪的冠状动脉侧支循环少，结扎时易发生恶性心律失常，且猪的冠脉分布与人的相似程度不及犬。兔体积小，冠状动脉细小，不易分离。因此，比格犬被国际医学、生物学界公认为是比较理想的实验动物。

建立慢性冬眠心肌模型的方法为球囊扩张和内膜剥脱，造成LAD狭窄，亦有开胸后使用缩窄环造成前降支慢性缩窄，但两者均有不足。前者对实验场地及实验人员要求高，在X线下进行实验，实验人员难以避免受辐射伤害，且花费较高，性价比欠佳；后者采用缩窄环造成前降支慢性闭塞，虽避免辐射伤害，但无法精确控制靶血管缩窄百分比，对后续实验结果可控性欠佳。

本研究采用开胸丝线结扎法制备犬冬眠心肌模型，通过游标卡尺测量前降支中远端直径，匹配不同直径钢丝造成前降支75%狭窄，参考相关文献[14-15]，以稍高于运动当量的运动量，即术后1周辅以每日室外运动4 h(上下午各2 h)，避免以往单纯圈养，长期低需氧量状态造成慢性心肌缺血不充分的问题。冬眠心肌鉴别方法众多[16-18]，尤以超声心动图多巴酚丁胺负荷试验性价比最高，术后此方法验证成功造成前降支供血区域心肌产生冬眠现象。此实验方法简单，对实验人员要求较低，花费少，为冬眠心肌领域的后续研究提供了合理的、稳定的模型制备方法。